%d0%a1%d0%be%d1%82%d0%be%d0%b2%d1%8b%d0%b9 — перевод на корейский язык

%d1%81%d0%be%d1%82%d0%be%d0%b2%d1%8b%d0%b9 — перевод на малайский язык

Салоны мобильной пенсии :: Финансы :: Газета РБК

Как сотовые операторы будут переводить накопления граждан в НПФ

Сотовые операторы активизировали предоставление клиентам услуг по переводу пенсионных накоплений в НПФ, пытаясь компенсировать падение доходов. Впрочем, встречный интерес НПФ к такого рода сотрудничеству — под вопросом

Фото: Юрий Смитюк/ТАСС

В 2017 году «Билайн» планирует запустить агентские услуги по переводу пенсионных накоплений граждан в НПФ, сообщили РБК два источника на пенсионном рынке. Информацию подтвердил представитель компании «ВымпелКом», отказавшись сообщить детали проекта. Предлагать россиянам распорядиться своими пенсионными средствами сотовый оператор будет наряду с другими финансовыми продуктами. Сейчас в сети «Билайн» клиенты могут застраховать жизнь, здоровье и имущество, а также погасить кредит или сделать денежный перевод.

Также, по информации источника на телекоммуникационном рынке, возможность предоставления сервиса для клиентов НПФ изучает и другой сотовый оператор — «МегаФон». Однако в самой компании эту информацию не подтвердили, сообщив, что пока не видят потребности у клиентов в данной услуге. Согласно информации на сайте сотового оператора, сейчас компания «МегаФон» предлагает перевести средства на банковскую карту или счет, а также перевести средства в системах денежных переводов «Юнистрим», CONTACT, Blizko, Anelik и «Почта России».

Предоставлять своим клиентам возможность перевести пенсию в НПФ намерен и другой сотовый оператор — МТС. Согласно информации на официальном сайте компании, до 27 января должен быть выбран фонд, для которого салоны розничной сети будут выступать по сути агентами. По условиям тендера выбор партнера будет делаться в зависимости от цены, которую готов заплатить НПФ за каждый оформленный в салоне договор, и от его готовности финансировать маркетинговую кампанию. Кроме того, НПФ должен быть готов использовать электронный документооборот при обмене информацией с сетью салонов связи. В тендере МТС участвуют НПФ «Доверие» и НПФ «Газфонд», сообщил топ-менеджер крупного пенсионного фонда. От официальных комментариев в НПФ «Доверие» отказались. В НПФ «Газфонд» не ответили на запрос РБК. В пресс-службе МТС сообщили, что итоги тендера будут подведены в первом квартале 2017 года.

Очередные попытки

Заработать на агентских услугах для НПФ операторы мобильной связи и сотовые ретейлеры пытаются не впервые. Однако столь масштабных попыток до сих пор не предпринималось. В частности, аналогичный сервис в декабре запустила и компания Tele2 в некоторых регионах. В пресс-службе Tele2 подтвердили, что в ряде салонов связи Tele2 уже можно получить эту услугу. «Мы рассматриваем возможность предоставления таких сервисов опционально», — сказал официальный представитель сотового оператора. Впрочем, в call-центре Tele2 на вопрос об услуге по переводу пенсионных накоплений сообщили, что такого сервиса в офисах продаж не предоставляется, и посоветовали обратиться в «Евросеть» или «Связной».​

В качестве другого примера эксперты называют сотрудничество НПФ «Электроэнергетики» с сотовым ретейлером «Евросеть». «В 2012–2013 годах через «Евросеть» активно предлагал свои услуги НПФ «Электроэнергетики». Около 20–25% всех договоров, заключенных фондом, приходило именно через этот канал продаж», — рассказал гендиректор компании «Пенсионный партнер» Сергей Околеснов.

В компании «Евросеть» сообщили, что в декабре 2015 года временно приостановили услугу «Перевод накопительной части пенсии». Сейчас ведутся переговоры с потенциальным контрагентом и планируется возобновить предоставление данной услуги с 1 марта 2017 года, рассказала директор управления телекоммуникационных услуг и дополнительных сервисов «Евросети» Мария Шалина.

Сейчас перевести свои пенсионные накопления граждане могут также через сеть салонов «Связной». Как сообщил РБК официальный представитель компании Сергей Тихонов, воспользоваться возможностью перевода накопительной части пенсии в НПФ можно в 950 городах. «Услуга пользуется популярностью и приносит нам определенный доход», — сказал он. «Связной» сотрудничает с двумя НПФ — «Газфондом» и «Доверием». С 2009 года ретейлер также предлагал гражданам перевести пенсию в НПФ «КИТ Финанс» (входит в группу «Газфонда»), а в 2015– 2016 годах через сеть «Связного» перевести свою пенсию гражданам предлагал НПФ «Европейский пенсионный фонд» (присоединен к НПФ «Сафмар» группы Микаила Шишханова). «Это был очень большой и существенный канал продаж для фонда. Доля продаж через сотового ретейлера достигала 15–20%», — вспоминает исполнительный директор НПФ «Сафмар» Евгений Якушев.

Фактор замещения​

Попытка сотовых операторов освоить новые финансовые услуги связана с падением их доходов от основного вида деятельности. «В условиях насыщения рынка сотовой связи и обострившейся конкуренции прибыль операторов снижается, поэтому они пытаются компенсировать это за счет комиссионных доходов от партнеров, финансовые услуги которых они продают», — говорит аналитик iKs-Consulting Максим Савватин.

В МТС называют и другие цели: намерение компании увеличить объем продаж других продуктов и сервисов за счет кросс-продаж, а также повысить лояльность абонентов МТС за счет предоставления социально важной услуги на безвозмездной для граждан основе. Аналогичные цели назывались и при выходе сотовых операторов на рынок микрокредитования. Как ранее писал РБК, в конце 2016 года сразу два оператора, МТС и «Билайн», стали предоставлять агентские услуги по получению их клиентами финансирования в виде микрозаймов от участвующих в проекте МФО.

Риск недоверия

Эксперты, опрошенные РБК, скептически отнеслись к планам сотовых операторов освоить рынок пенсионного страхования. «Это может быть важным каналом продаж, что доказал пример НПФ «КИТ Финанс», который в 2009 году резко увеличил объемы привлечения пенсионных накоплений за счет того, что заключил агентский договор с сетью «Связного», — вспоминает глава крупного НПФ. Однако комиссии, которые берут сотовые операторы и салоны связи с НПФ за свои агентские услуги, могут быть выше банковских, что снижает их привлекательность в статусе агентов НПФ по сравнению с кредитными организациями. «Наш фонд предлагает перевести свои пенсионные накопления через банки группы ВТБ и ряд банков-партнеров. Мы не используем услуги сетей сотовой связи», — рассказала гендиректор НПФ ВТБ Лариса Горчаковская. Она отметила, что стоимость привлечения клиентов через офисы операторов может быть выше, чем через специализирующиеся на продаже различных финансовых продуктов банки».

Также, по ее словам, банковский канал продаж более понятен с точки зрения качества клиентов. «Мы никогда не делали ставку на сотовых ретейлеров, хотя в различное время они занимали до 10–15% продаж. Сейчас работаем в основном с банками», — говорит глава другого НПФ из топ-10. «Аудитория посетителей салонов связи — это в основном молодые люди, которые покупают сотовые телефоны. Сумма накоплений на их счетах не так велика, поэтому фонды в основном делают ставку на банковский канал продаж, где более состоятельные клиенты», — подтверждает Якушев. По оценкам Сергея Околеснова, средний счет накоплений клиентов, пришедших в НПФ через салоны сотовой связи, как правило, на 20–30% ниже, чем в среднем по рынку. Он отмечает, что в сети салонов сотовой связи приходят люди, которых интересуют другие услуги и сервисы. «Поэтому рассчитывать на лояльность таких клиентов, между делом подписавших договор о переводе пенсионных накоплений, НПФ не стоит. Они с такой же легкостью могут поменять фонд в следующем году», — считает Околеснов.

холдинг сотовый — английский перевод

Перенос содержимого с устройства Android на устройство iPhone, iPad или iPod touch

Готовы к переходу на ОС iOS? Загрузите приложение «Перенос на iOS», которое поможет перейти от использования устройства Android к работе с новым iPhone, iPad или iPod touch.

Подготовка

• Убедитесь, что функция Wi-Fi на устройстве Android включена. 
• Подключите новое устройство iOS и устройство Android к их источникам питания.
• Убедитесь, что содержимое, которое требуется переместить, включая содержимое на внешней карте памяти Micro SD, поместится на вашем новом устройстве iOS.
• Если требуется перенести закладки из браузера Chrome, обновите Chrome на устройстве Android до последней версии.

Команда «Перенести данные с Android»

Открытие приложения «Перенос на iOS»

На устройстве Android откройте приложение «Перенос на iOS». Если у вас нет приложения «Перенос на iOS», можно нажать кнопку QR-кода на новом устройстве iOS и отсканировать QR-код с помощью камеры устройства Android, чтобы открыть магазин Google Play. Нажмите «Продолжить» и ознакомьтесь с условиями использования. Чтобы продолжить, нажмите «Принимаю».

Ожидание кода

Когда появится экран «Перенос с Android», нажмите на устройстве iOS «Продолжить». Подождите, пока не появится 10- или 6-значный код. Если на устройстве Android отображается сообщение о плохом качестве подключения к Интернету, игнорируйте его.

Использование кода

Введите полученный код на устройстве Android.

Подключение к временной сети Wi-Fi

Устройство iOS создаст временную сеть Wi-Fi. Когда появится запрос, нажмите «Подключиться», чтобы подключить устройство Android к этой сети. Подождите, пока не появится экран «Перенос данных».

Выбор содержимого и ожидание

На устройстве Android выберите содержимое, которое нужно перенести, и нажмите «Продолжить». Даже если на устройстве Android появится уведомление о завершении процесса, ничего не предпринимайте, пока индикатор загрузки на устройстве iOS не заполнится. Процесс переноса может занять некоторое время в зависимости от объема переносимых данных.

Переносится следующее содержимое: контакты, история сообщений, фотографии и видеозаписи с камеры, фотоальбомы, файлы и папки, настройки универсального доступа, настройки дисплея, веб-закладки, учетные записи электронной почты и календари. Кроме того, будут перенесены некоторые из бесплатных приложений, если они доступны и в Google Play, и в App Store. После завершения переноса можно будет загрузить любые бесплатные приложения, для которых была найдена соответствующая версия в App Store.

Настройка устройства iOS

Когда индикатор загрузки на устройстве iOS дойдет до конца, нажмите «Готово» на устройстве Android. Затем нажмите «Продолжить» на устройстве iOS и завершите его настройку, следуя инструкциям на экране.

Завершение

Убедитесь, что все содержимое перенесено. Перенос музыки, книг и файлов PDF необходимо выполнить вручную.

Чтобы загрузить приложения, которые были установлены на устройстве Android, перейдите в App Store на устройстве iOS и загрузите их.

Помощь при переносе данных

• До завершения переноса не следует выполнять на устройствах никаких действий. Например, на устройстве Android приложение «Перенос на iOS» должна все время оставаться открытой на экране. Если во время переноса данных вы использовали другое приложение или принимали телефонные вызовы на устройстве Android, содержимое не будет перенесено.
• На устройстве Android необходимо отключить все приложения и настройки, которые могут повлиять на стабильность подключения к сети Wi-Fi, например Sprint Connections Optimizer или «Интеллектуальное переключение сетей». После этого найдите пункт Wi-Fi в меню настроек и удалите все известные сети, удерживая их названия и выбирая соответствующий вариант. Затем повторите попытку переноса.
• Перезапустите оба устройства и повторите попытку.
• На устройстве Android отключите соединение с сотовой сетью передачи данных. Затем повторите попытку переноса.

Помощь после переноса данных

Информация о продуктах, произведенных не компанией Apple, или о независимых веб-сайтах, неподконтрольных и не тестируемых компанией Apple, не носит рекомендательного или одобрительного характера. Компания Apple не несет никакой ответственности за выбор, функциональность и использование веб-сайтов или продукции сторонних производителей. Компания Apple также не несет ответственности за точность или достоверность данных, размещенных на веб-сайтах сторонних производителей. Обратитесь к поставщику за дополнительной информацией.

Дата публикации: 02 октября 2021 г.

Мобильное приложение eGov mobile | Электронное правительство Республики Казахстан

Мобильное приложение электронного правительства eGov mobile доступно для скачивания в Google Play (требуемая версия Android — 5.0 или более поздняя), AppGallery, AppStore (требуемая версия iOS — 11.3 или более поздняя). 

Авторизоваться в приложении можно с ЭЦП или посредством одноразового пароля*.

Мобильное приложение eGov mobile позволяет использовать ЭЦП максимально удобно:

• Выпускайте ЭЦП с самого мобильного приложения в считанные минуты без необходимости посещения ЦОН
• Привяжите имеющуюся ЭЦП к 4-х значному PIN коду и встроенной биометрии вашего устройства (Face ID, Touch ID) и вы можете больше не отвлекаться на выбор ЭЦП и ввод пароля каждый раз при авторизации и получении услуг.

На главной странице приложения представлены:

Краткие инструкции для пользователя по работе с приложением. Инструкции выполнены в виде историй, знакомых пользователям по социальным сетям.

QR сканер. С  помощью сканирования QR доступны: 

• Авторизация и подписание услуг на сайте egov.kz посредством сканирования QR кода в приложении. 
• Оплата государственной пошлины за оказание услуг в ЦОН
• Также посредством сканирования QR кода может быть получен доступ к просмотру документа третьего лица в сервисе «Цифровые документы». eGov mobile посредством вызова сервисов государственных органов РК, загружает документ, к которому был выделен доступ.

Для пользователя предоставляющего доступ к своим цифровым документам достаточно зайти в «Цифровые документы», открыть необходимый документ и нажать на кнопку «Открыть доступ», после чего генерируется уникальный QR-код, доступный для одноразового сканирования третьим лицом. 

В разделе «Популярные услуги» выведены наиболее востребованные справки, с полным списком услуг можно ознакомиться, перейдя по ссылке «Все услуги» либо в разделе «Каталог услуг». 

В «Каталоге услуг» услуги сгруппированы по соответствующим категориям. В разделе «История заказов» доступен просмотр статуса заявки и результата оказания услуги. Полученный документ вы легко можете сохранить на свой смартфон или поделиться им посредством почты или мессенджера.

В разделе «Сервисы» представлены:

• «Цифровые документы» — сервис по хранению личных электронных документов в приложении eGov Mobile. Также сервис предоставляет возможность гражданину по его согласованию предоставить третьим лицам доступ к документам.
• «Электронная биржа труда» — единая цифровая площадка по трудоустройству, обеспечивающая возможность для поиска работы. Посредством данного сервиса вы можете:

— создать резюме, получить приглашения на собеседования от работодателей, откликнуться на вакансию или отказаться от приглашения;

— создать подписку на вакансии по заданным параметрам и получать уведомления на электронную почту.

— пройти профориентационное тестирование, получив результат определить наиболее близкие Вам профессии.

• «Паспорт здоровья» позволяет получить клинический документ, в котором хранится структурированная информация о состоянии здоровья пациента, а так же данные прикрепление к медицинской организации, диспансерный учет, стационарные данные, результаты лабораторных исследований и т.д. с возможностью выгрузки документа в программу «Здоровье» на iOS.
• «Пенсионный калькулятор» позволяющий рассчитать предположительный размер ваших будущих пенсионных выплат.

В разделе «Уведомления» вы сможете просмотреть все уведомления об изменении статуса услуг  и информационные сообщения.

В «Профиле» отображается персональная информация из различных государственных баз данных о семье, личных документах, социальный статус, информация об участии в юридическом лице, информация об авто и недвижимости и т.д. Также Доступна информация о сроках действия ЭЦП.

В разделе Профиля «Мои карты» вы можете привязать платежную карту,  для оплаты государственных пошлин. 

* Одноразовый пароль – sms-уведомление с проверочным кодом, которое приходит на мобильный телефон пользователя после отправки запроса. Для использования одноразового пароля пользователь должен быть зарегистрирован в Базе мобильных граждан.

Отсканируйте QR и скачайте приложение прямо сейчас!

    Play Market, Android                          AppStore iOS                          App Gallery, Huawei

                                                                                                                   (Android)

 

Терапия с переносом Т-клеток — Иммунотерапия

Терапия с переносом Т-клеток может вызывать побочные эффекты, которые люди испытывают по-разному. Возможные побочные эффекты и их серьезность будут зависеть от того, насколько вы здоровы до лечения, от вашего типа рака, степени его распространенности, типа терапии с переносом Т-клеток, которую вы получаете, и от дозы.

Врачи и медсестры не могут знать наверняка, когда и возникнут ли побочные эффекты или как они повлияют на вас. Итак, важно знать, какие признаки искать и что делать, если у вас возникнут проблемы.

CAR Т-клеточная терапия может вызвать серьезный побочный эффект, известный как синдром высвобождения цитокинов. Этот синдром возникает, когда перенесенные Т-клетки или другие иммунные клетки, отвечающие на новые Т-клетки, высвобождают большое количество цитокинов в кровь.

Цитокины — это иммунные вещества, которые выполняют множество различных функций в организме. Внезапное повышение их уровня может вызвать:

• лихорадка
• тошнота
• головная боль
• сыпь
• учащенное сердцебиение
• низкое кровяное давление
• проблемы с дыханием

У большинства людей есть легкая форма синдрома выброса цитокинов.Но у некоторых людей это может быть тяжелым или опасным для жизни.

Кроме того, хотя CAR T-клетки предназначены для распознавания белков, которые обнаруживаются только на раковых клетках, они также могут иногда распознавать нормальные клетки. В зависимости от того, какие нормальные клетки распознаются, это может вызвать ряд побочных эффектов, включая повреждение органов.

Терапия TIL может вызвать синдром утечки капилляров. Этот синдром вызывает утечку жидкости и белков из крошечных кровеносных сосудов в окружающие ткани, что приводит к опасно низкому кровяному давлению.Синдром капиллярной утечки может привести к полиорганной недостаточности и шоку.

Для получения дополнительной информации о CAR T-клеточной терапии см. CAR T-клеточная терапия: разработка иммунных клеток пациентов для лечения их рака.

Получите доступ к 508-совместимой версии этого видео.

Производство CAR Т-клеток для расширения исследований в области иммунотерапии рака

Для расширения и ускорения исследований в области иммунотерапии NCI разработала программу по производству препаратов для лечения CAR Т-клетками для использования в клинических испытаниях.

Адаптивная терапия переноса клеток — Альянс исследований меланомы

Онкологи могут лечить многие виды рака, включая меланому, с помощью лекарств, стимулирующих иммунную систему организма. Этот тип лечения, известный как иммунотерапия, является системным, что означает, что лечение распространяется на все части вашего тела.

Как системное лечение рака, иммунотерапия эффективна в борьбе с распространенным и метастатическим раком (раком, который распространился из исходной опухоли на другие части тела).Приемная терапия клеточного переноса доставляет иммунные клетки для уничтожения раковых клеток. Часто переносимая иммунная клетка является Т-клеткой. Это очень мощная иммунная клетка, способная убивать раковые клетки при контакте.

Узнайте больше о том, как работает иммунотерапия.

Что такое адоптивная терапия переноса клеток?

Адоптивная терапия с переносом клеток, или АКТ, включает в себя ряд различных типов иммунотерапевтического лечения. Все они используют иммунные клетки, которые выращиваются в лаборатории в больших количествах, а затем вводятся в организм для борьбы с раком.Иногда используются иммунные клетки, которые естественным образом распознают меланому, а в других случаях они модифицируются, чтобы заставить их распознавать и убивать клетки меланомы. Существует несколько типов ACT:

• TIL (лимфоциты, инфильтрирующие опухоль): Это когда Т-клетки выращиваются из самой опухоли
• Эндогенная Т-клеточная терапия: Это когда опухолеспецифические Т-клетки выращиваются из крови
• CAR T: Это когда ген химерного антитела / Т-клеточного рецептора вводится в периферические Т-клетки
• Т-клетки, трансдуцированные TCR: Это происходит, когда ген рецептора Т-клеток, созданный для распознавания опухоли, вводится в периферические Т-клетки

TIL-терапия — это вид иммунотерапии, впервые примененный в U.S. Национальный институт рака. Он все еще находится в стадии исследования и не был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). Это означает, что вы можете получить это лечение только при участии в клинических испытаниях.

Среди АКТ при меланоме наиболее распространена терапия TIL. По состоянию на октябрь 2017 года было проведено 24 клинических испытания TIL с привлечением пациентов с меланомой по сравнению с 1 клиническим испытанием CAR-T.

Подробнее о клинических исследованиях меланомы.

Как работает адоптивная терапия с переносом клеток?

ACT с TIL увеличивает количество противораковых клеток в вашей иммунной системе и может сделать их сильнее.

В процедуре:

• Врачи выделяют определенный тип лейкоцитов, называемых Т-клетками, из хирургически удаленной опухоли меланомы.
• Врачи могут модифицировать клетки в лаборатории, чтобы повысить их эффективность против рака, обогащая наиболее активные клетки. Т-клетки также «разрастаются», чтобы увеличить их количество.
• Пациенту будет назначена химиотерапия и / или лучевая терапия, чтобы повысить вероятность того, что Т-клетки снова начнут активно расти в организме.
• Пациенту вводят выращенные в лаборатории клетки путем инфузии.

Исследователи полагают, что, поскольку терапия TIL использует системное введение большого количества иммунных клеток, они могут уменьшить или уничтожить опухоли по всему телу.

Какие пациенты получают пользу от терапии с адаптивным переносом клеток?

Пациенты с меланомой на поздней стадии могут получить АКТ в клинических испытаниях. Цель состоит в том, чтобы недавно выращенные в лаборатории иммунные клетки нацелены на любые остаточные клетки меланомы и убивают их, что препятствует их репликации (самовоспроизводству) и распространению.

Как проводится адоптивная терапия с переносом клеток?

Пациенты получают АКТ внутривенно (в вену). Дозировки и сроки лечения варьируются в зависимости от используемого метода АКТ и, вероятно, потребуют госпитализации.

Каковы цели адоптивной терапии с переносом клеток?

Исследователи работают над тем, чтобы показать, что ACT может:

• Контролировать размножение и распространение клеток меланомы
• Редукционная рецидивирующая и метастатическая меланома

Лечение меланомы, такое как АКТ, имеет побочные эффекты, которые иногда могут быть серьезными.Пациентам следует поговорить со своим врачом, чтобы узнать больше о побочных эффектах АКТ и других вариантах лечения меланомы.

Что я должен спросить у врача об адаптивной терапии переноса клеток?

Если вы хотите узнать больше об АКТ в клинических испытаниях, вот несколько вопросов, которые вы должны задать своим врачам:

• Имею ли я право на АКТ?
• Какой у вас опыт работы с ACT?
• Подходит ли АКТ для лечения меланомы?
• Есть ли мне альтернатива ACT?
• Насколько успешной была ACT для таких пациентов, как я?
• Каковы побочные эффекты ACT?
• Есть ли какие-либо клинические испытания ACT, к которым я могу присоединиться?
• Какие еще методы лечения меланомы на поздних стадиях одобрены FDA?
• Каковы риски и преимущества доступных вариантов лечения?
• Каковы цели моего лечения?

Последние методы лечения меланомы на поздних стадиях

Узнайте больше о новейших и наиболее эффективных методах лечения:

Исследование меланомы

Альянс исследований меланомы является крупнейшим некоммерческим спонсором исследований меланомы во всем мире.С 2007 года мы напрямую выделили более 131 миллиона долларов в виде инновационных грантов на улучшение профилактики, выявления и лечения меланомы. Мы также привлекли дополнительные 415 миллионов долларов внешних средств на исследования. Узнайте больше о нашем финансируемом исследовании.

Последнее обновление: август 2021 г.

Перенос адоптивных клеток — обзор

1.1 Успешная иммунотерапия адоптивного переноса клеток (ACT) основана на ранней дифференцировке CD8

⁺ субпопуляций Т-клеток

Перенос адоптивных клеток (ACT) опухолево-реактивных Т-лимфоцитов является мощной иммунотерапией против солидных и гематологические злокачественные новообразования (Rosenberg & Restifo, 2015).Вместе с блокадой иммунных контрольных точек ACT продемонстрировала, что иммунная система может эффективно отторгать сформировавшиеся опухоли у людей. Первоначально протоколы ACT требовали выделения инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), их экстенсивного размножения in vitro до огромных количеств с аутологичной опухолью и цитокинами с последующей инфузией пациенту. Совсем недавно специфичность аутологичных или, в некоторых случаях, сторонних Т-клеток из периферической крови была перенаправлена ​​лентивирусно-трансдуцирующими Т-клеточными рецепторами (TCR) или химерными антигенными рецепторами (CAR), специфичными для антигенов, сверхэкспрессируемых опухолевыми клетками (June et al. al., 2014). ACT трансдуцированных CAR Т-клеток, распознающих CD19 (CART-19), антиген, который присутствует при некоторых В-клеточных неоплазиях в дополнение к нормальным В-клеткам, был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для лечения рецидивов / рефрактерный острый лимфобластный лейкоз и диффузная В-крупноклеточная лимфома. Благодаря своему успеху, подход CAR-T-клеток в настоящее время разрабатывается или тестируется для широкого спектра гематологических и солидных опухолей, включая, помимо прочего, антиген созревания B-клеток (BCMA) для множественной миеломы, CD20 для рецидивов или рефрактерных. В-клеточная неходжкинская лимфома, мезотелин (MSLN) для немелкоклеточного рака легкого, мезотелиома и протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (которые имеют обильную экспрессию MSLN) и рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (Her-2) для Her-2- положительный рак груди или глиомы.Эти цели были протестированы на доклиническом уровне и дали многообещающие результаты (Forsberg et al., 2019; Ye, Lou, Lu, & Fan, 2019; Yu et al., 2017; Zhang et al., 2016).

Хотя мощный Т-клеточный иммунитет к ACT зависит от множества механизмов, устойчивость перенесенных клеток in vivo является одной из основных детерминант успеха лечения (Pilipow et al., 2015). Множество данных показали, что устойчивость противоопухолевой функции в значительной степени зависит от состояния дифференцировки во время переноса, когда менее дифференцированные Т-клетки памяти, такие как память стволовых клеток (T _SCM ) и центральная память (T _CM ) В этом отношении наиболее эффективны Т-клетки.Эти подмножества обладают повышенной долговечностью (Biasco et al., 2015; Graef et al., 2014; Ladell et al., 2008; Lugli, Dominguez, et al., 2013), превосходной способностью к восстановлению (Cieri et al., 2015 ; Gattinoni et al., 2011; Roberto et al., 2015), что может быть связано с их большой длиной теломер и динамической пролиферативной природой in vivo (Ahmed et al., 2016), их способностью дифференцироваться в несколько подмножеств Т-клеток. (Biasco et al., 2015; Cieri et al., 2015; Oliveira et al., 2015; Roberto et al., 2015) и опосредовать мощную противоопухолевую активность (Gattinoni et al., 2011; Klebanoff et al., 2005) по сравнению с более дифференцированными эффекторными Т-клетками памяти (T _EM ) и терминальными эффекторными (T _TE ) Т-клетками (обзор в Mahnke, Brodie, Sallusto, Roederer, & Lugli, 2013). Эти свойства были связаны с усиленной экспрессией сети факторов транскрипции, а также с производством метаболитов, которые сочетают обширную пролиферацию с способностью к самообновлению. Однако частота стволовых Т-клеток мала ex vivo, что ограничивает потенциальные трансляционные применения.С этой целью было разработано несколько новых стратегий для их генерации из более обильных, незарегистрированных наивных T (T _N ) клеток.

Терапия с переносом клеток при раке: прошлое, настоящее и будущее

Терапия с переносом клеток при раке в последнее время быстро прогрессирует, и иммунотерапия признана четвертым противоопухолевым методом после операции, химиотерапии и лучевой терапии. Лимфоциты, используемые для терапии с переносом клеток, включают дендритные клетки, естественные клетки-киллеры (NK) и Т-лимфоциты, такие как инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) и цитотоксические Т-лимфоциты (CTL).Активированные in vitro или сконструированные иммунные клетки могут перемещаться в раковые ткани, вызывая стойкий противоопухолевый иммунный ответ, что очень важно, особенно после иммуносупрессивных методов лечения, таких как химиотерапия. В этом обзоре мы рассмотрели последние достижения в исследовании дендритных клеток, NK-клеток и Т-клеток для лечения раковых клеток человека.

1. Введение

Вдохновленный наблюдением полной регрессии опухоли у пациента мужского пола с рецидивирующей саркомой после послеоперационной инфекции рожи, Коли лечил пациентов с запущенной саркомой смешанными токсинами рожистого стрептококка и продигиозной палочки в 1891 году [1, 2] , таким образом, положив начало истории иммунотерапии рака человека.К сожалению, с тех пор был достигнут ограниченный прогресс. В последнее время большие успехи в адоптивной терапии клеточного переноса (ACT) и разработка противораковых антител, таких как ипилимумаб, возродили интерес научного сообщества к противоопухолевой иммунотерапии и терапии цитокинами. Теперь иммунотерапия признана четвертым противоопухолевым методом после операции, химиотерапии и лучевой терапии.

Существует два типа иммунотерапии рака: активная иммунотерапия и пассивная иммунотерапия.Активная иммунотерапия в основном относится к вакцинам, иммунным адъювантам и цитокинам, тогда как пассивная терапия состоит из терапии на основе иммуномодулирующих антител и адоптивной иммунотерапии. Активная иммунотерапия может активировать эндогенную иммунную систему, а пассивная иммунотерапия обеспечивает или усиливает иммунную реакцию у онкологических больных путем введения антител или эффекторных клеток, продуцируемых in vitro. Среди активной иммунотерапии цитокины, включая интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-12 (IL-12), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор некроза опухоли (TNF) — α и интерфероны (IFN) секретируются иммунными клетками и играют ключевую роль в активной иммунотерапии.ИЛ-2 является важным фактором роста лимфоцитов. FDA доказало, что он подходит для лечения запущенной меланомы и рака почек. Однако серьезная системная токсичность высоких доз ИЛ-2 ограничивает его широкое применение [3].

В зависимости от различных переносимых иммуноцитов, терапия клеточного переноса (CTT) включает активную иммунотерапию и пассивную иммунотерапию или ACT. В адоптивной терапии с переносом клеток используются специфические для пациента аутологичные или согласованные с HLA аллогенные лимфоциты, активированные in vitro факторами роста, в то время как дендритные клетки часто использовались в терапии с активным переносом клеток, чтобы вызвать противоопухолевый иммунный ответ.Иммуноциты, используемые при АКТ, можно разделить как минимум на два типа. Первый тип включает лимфокин-активированные киллеры (LAK), CIK (цитокин-индуцированные киллеры) и NK-клетки, все из которых могут опосредовать регрессию рака без ограничения MHC. Другой тип эффекторных клеток относится к инфильтрирующим опухоль лимфоцитам (TIL) и цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL), оба из которых распознают специфические опухолевые антигены, представленные молекулами MHC.

2. Перенос клеток на основе DC

После идентификации дендритных клеток (DC) как наиболее эффективных антигенпрезентирующих клеток (APC) in vivo [4] вакцины на основе DC вызвали больший интерес.Дендритные клетки обладают особыми свойствами опосредовать перекрестные помехи между врожденными и адаптивными иммунными ответами, а зрелые ДК могут стимулировать активацию аутологичных опухолеспецифических CD8 + Т-клеток для уменьшения массы опухоли [5]. DC могут быть выделены из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), размножены in vitro и заражены широким спектром специфичных для рака антигенов.

Sipuleucel-T (Provenge) — первая терапевтическая противораковая вакцина, одобренная Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения кастрационно-резистентного минимально симптоматического рака простаты в апреле 2010 года.Sipuleucel-T представляет собой вакцину на основе DC, которая расширена ex vivo слитым белком (PA2024), состоящим из фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и кислой фосфатазы простаты [6]. Три важных исследования фазы III продемонстрировали преимущества в улучшении общей выживаемости при распространенном раке простаты [7–9]. В метаанализе рандомизированных клинических испытаний с участием 737 пациентов с метастатическим кастратрезистентным раком простаты (mCRPC) общая выживаемость пациентов, получавших сипулеуцел-T, по сравнению с лечением плацебо была значительно дольше с соотношением рисков ( HR) для общей выживаемости 0.73 (95% ДИ: 0,61–0,88;). Однако время прогрессирования заболевания не увеличивалось (ОР = 0,89, 95% ДИ: 0,75–1,05;). Примечательно, что о серьезных побочных эффектах не сообщалось. По сравнению с контрольной группой, объединенные относительные риски (ОР) всех нежелательных явлений (ОР = 1,03, 95% ДИ: 1,00–1,05;), нежелательных явлений 3-5 степени (ОР = 0,98, 95% ДИ: 0,79–1,22). 😉 и цереброваскулярные события (ОР = 1,93, 95% ДИ: 0,73–5,09;) не были значительно выше у мужчин, получавших сипулеуцел-Т. Имеется больше сообщений об исследованиях фазы II / III, показывающих многообещающие клинические результаты вакцин на основе ДК, и результаты связаны с индуцированным вакциной размножением опухолеспецифических эффекторных Т-клеток [10, 11].

Незрелые ДК не только плохо функционируют при презентации антигена, но также вызывают иммунную толерантность [5]. Следовательно, крайне важно способствовать созреванию и дифференцировке DCs для блокирования супрессивных эффектов на экзогенные DC при совершенствовании терапии на основе DC. Например, эндогенные иммуносупрессивные ДК могут быть трансформированы в высокоиммуностимулирующие клетки для индукции устойчивых противоопухолевых ответов путем введения наночастиц, несущих иммуностимулирующую miRNA miR-155 [12]. Кроме того, комбинация интерлейкина-4 (IL-4) / GM-CSF / опухолевых лизатов (TL) / TNF- α вызвала наибольшую дифференцировку и созревание DC у пациентов с опухолями костей и мягких тканей в отличие от комбинация IL-4 / GM-CSF / TL и комбинация IL-4 / GM-CSF / OK-432 [13].Генно-инженерные DCs, секретирующие рецептор VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия), могут нейтрализовать растворимый VEGF и повысить экспрессию костимулирующих молекул, провоспалительных цитокинов и хемокинов, что приведет к усилению противоопухолевого иммунного ответа [14]. Точно так же трансдукция DC вирусными векторами, кодирующими иммуностимулирующие молекулы, такие как CD80 / CD86 и IL-12, также является хорошим выбором для улучшения противоопухолевого иммунитета [15-17]. Кроме того, нокдаун иммуносупрессивного фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) в DC увеличивал эффективную пролиферацию и активность Т-клеток и уменьшал количество CD4 (+) CD25 (+) Foxp3 (+) Treg-клеток в молочной железе мыши. модель рака [18].В качестве альтернативы вакцина на основе DC в сочетании с блокадой CTLA-4 и истощением Treg-клеток с помощью анти-CD25 Ab может улучшить эрадикацию опухоли на мышиной модели рака толстой кишки [19].

3. Перенос клеток на основе NK-клеток

NK-клетки, фенотипически определенные как лимфоциты CD3 ^— CD56 ⁺ , могут быстро лизировать определенные клетки-мишени без ограничения МНС. Цитотоксичность NK-клеток в основном зависит от баланса между активирующими и тормозящими сигналами [20–22]. Ингибирующие рецепторы NK-клеток, включая иммуноглобулиноподобный рецептор киллерных клеток (KIR) и CD94 / NKG2A / B, могут специфически воздействовать на молекулы MHC класса I, экспрессируемые почти всеми нормальными клетками, и приводить к ингибированию активности уничтожения NK-клеток [23] .NK-клетки активируются для уничтожения клеток-мишеней, которые подавляют экспрессию MHC-I. Следовательно, опухолевые клетки, которые экспрессируют молекулы с низким содержанием MHC-I, чтобы избежать иммунного надзора, являются идеальными клетками-мишенями для NK-клеток, чтобы оказывать противоопухолевый эффект [24]. Некоторые опухолевые клетки, обладающие достаточным количеством MHC-I, также отторгаются NK-клетками, которые обнаруживают индуцированные стрессом самолиганды через свои активирующие рецепторы, такие как рецептор NKG2D [25]. Следовательно, лизис клеток, опосредованный NK-клетками, можно усилить с помощью антител, блокирующих рецепторы, ингибирующие NK, или антител, нацеленных на активирующие рецепторы.Например, антитело, блокирующее KIR, в значительной степени способствовало ответам NK-клеток на Ab-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в модели рака человека [26]. Другой эксперимент с использованием РНК-интерференции продемонстрировал, что наблюдается подавление NKG2A и увеличение лизиса NK-клеток на 40% [27]. С другой стороны, новые методы лечения, направленные на лиганды NKG2D, экспрессируемые на опухолевых клетках, а не на нормальных, достигли доклинического успеха и в настоящее время проходят клинические испытания [28, 29].

Терапевтические NK-клетки могут быть получены из нескольких источников, включая аутологичные NK-клетки, аллогенные NK-клетки, линии NK-клеток, генетически модифицированные NK-клетки, гемопоэтические стволовые клетки (HSC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) [23].Путем цитокиновой стимуляции аутологичные NK-клетки могут трансформироваться в лимфокин-активированные киллеры (LAK) и проявлять большую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток [23, 30, 31]. В 1985 году Розенберг и др. представил клетки LAK для лечения метастатической меланомы, резистентной к стандартным методам лечения. У 11 из 25 пациентов наблюдалась объективная регрессия рака, в том числе у одного наблюдался полный регресс опухоли до 10 месяцев. Это захватывающее достижение открыло новую эру адоптивной иммунотерапии.Однако во всех более поздних исследованиях фазы II и фазы III с использованием терапии LAK в сочетании с терапией IL-2 сообщалось о частоте клинического ответа около 15–20%. Этот показатель не был выше по сравнению с терапией одним ИЛ-2 [32]. Низкие частоты объясняются предотвращением атаки NK-клеток на «собственные» -MHC-экспрессирующие опухолевые клетки из-за ингибирующих KIR или экспансией регуляторных Т-клеток, индуцированной IL-2 [33]. Аллореактивные NK-клетки с несоответствием KIR-лиганда между пациентами и их донорами могут преодолеть это препятствие и продемонстрировать большую активность в отношении уничтожения опухолей при остром миелоидном лейкозе (AML), не вызывая реакции «трансплантат против хозяина» [34–36].Что касается солидных опухолей, аллореактивные NK-клетки также играют терапевтическую роль с минимальной токсичностью [37]. В клинических испытаниях фазы I сообщалось, что адоптивный перенос аллогенных NK-клеток, активированных и размноженных с помощью ИЛ-15 и гидрокортизона (ГК) in vitro, безопасен и потенциально эффективен в сочетании с химиотерапией у пациентов с распространенным немелкоклеточным раком легкого [38] . Этот подход имеет недостаток, заключающийся в том, что аллогенные NK-клетки с несовпадением KIR могут генерировать иммуноопосредованное отторжение из-за несоответствия MHC [39].

По сравнению с аутологичными или аллогенными NK-клетками, линии NK-клеток, расширенные в условиях надлежащей производственной практики (GMP), могут обеспечить достаточное количество для клинической адоптивной терапии с более простыми и простыми процедурами. Среди линий NK-клеток только клетки NK-92 одобрены FDA для исследовательского лечения пациентов с запущенной злокачественной меланомой и почечно-клеточным раком [40–43]. Однако другие линии NK-клеток, такие как клетки KHYG-1 и NKL, демонстрируют больший противоопухолевый эффект, чем клетки NK-92, что открывает терапевтические перспективы [44, 45].

Убедительные доказательства подтверждают, что генетическая модификация NK-клеток является еще одной эффективной стратегией повышения эффективности уничтожения опухолевых клеток. Подходы с генетической манипуляцией включают экспрессию трансгенных цитокинов, повышающую регуляцию активирующих рецепторов, подавление ингибирующих рецепторов и перенаправление NK-клеток через химерные опухолевые антиген-специфические рецепторы [23]. Недавно было обнаружено, что тканеспецифические NK-клетки экспрессируют разные фенотипы и играют разные иммунологические роли в зависимости от органов [46].Например, NK-клетки печени могут убивать опухолевые клетки, которые в противном случае устойчивы к NK-клеткам селезенки [47]. Следовательно, генетически модифицированные тканеспецифические NK-клетки могут быть использованы для лечения рака, происходящего из разных органов.

До сих пор АКТ с NK-клетками показала многообещающие результаты в основном у больных гематологическим раком [33, 48, 49]. Напротив, терапия солидных опухолей на основе NK-клеток все еще была неудовлетворительной. Например, в клиническом исследовании с участием 8 пациентов с метастатической меланомой или почечно-клеточной карциномой, которых лечили аутологичными NK-клетками после режима лимфодеплецирующей химиотерапии, регрессии опухоли не наблюдалось, хотя высокие уровни циркулирующих NK-клеток сохранялись в течение нескольких месяцев [48 ].Активация NK-клеток перед передачей донорам кажется критической. Например, NK-клетки, предварительно активированные IL-12 / IL-15 / IL-18, а не IL-2, быстро пролиферировали, продуцировали высокий уровень интерферона γ (IFN γ ) и индуцировали выраженную регрессию опухоли [50].

В совокупности методы лечения рака на основе NK-клеток достигли лишь умеренного клинического успеха, и необходимы дальнейшие разработки для повышения клинической эффективности лечения рака на основе NK-клеток, такого как активация NK-клеток in vitro.

4. Перенос клеток на основе Т-клеток

4.1. Цитокин-активированные Т-клетки

Цитокин-активированные Т-клетки представляют собой гетерогенную популяцию CD3- и CD56-положительных, не ограниченных основным комплексом гистосовместимости (MHC), естественных киллеров (NK) -подобных Т-лимфоцитов, полученных из лимфоцитов периферической крови (PBL). ) и увеличивался in vitro моноклональным антителом против CD3 и различными цитокинами, такими как IL-2, IL-1 и IFN γ [51]. Цитокин-активированные Т-клетки обладают повышенной цитотоксической активностью по сравнению с лимфокин-активированными киллерными (LAK) клетками.Кроме того, клетки CIK, совместно культивируемые с DC, могут генерировать клетки DC-CIK, обладающие признаками сильной пролиферации, значительной цитотоксичности, достаточной секреции цитокинов и высокой экспрессии TCR. В настоящее время клетки CIK проходят испытания на предмет применения для лечения широкого спектра видов рака, таких как рак почек [52], рак желудочно-кишечного тракта [53], распространенный НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) [54] и гепатоцеллюлярная карцинома [55]. . Эти клинические испытания подтвердили безопасность ACT с клетками CIK, но предположили ограниченную эффективность.Ожидается, что клиническая эффективность может быть значительно улучшена путем добавления антител, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену (TAA) [51], или конструирования клеток CIK с молекулами опухолевого рецептора [56–58] или геном IL-2 [59].

Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL), выделенные из недавно резецированных опухолей, могут опосредовать лизис опухолевых клеток после инкубации in vitro с IL-2. Основными эффективными клетками TIL являются CD8 + Т-клетки, противоопухолевая функция которых может быть усилена IL-2. Розенберг и его коллеги лечили пациентов с метастатической меланомой путем адаптивного переноса TIL впервые в 1988 г., и эффективность оказалась неудовлетворительной [60].Вплоть до 2002 года впечатляющие результаты были достигнуты благодаря подготовке режима лимфодеплефикации перед приемным переводом. В этом клиническом исследовании девяносто трем пациентам с измеримой метастатической меланомой, резистентной к стандартным методам лечения, вводили аутологичные TIL в сочетании с введением IL-2 после лимфодеплецирующего препаративного режима (только химиотерапия или с облучением 2 или 12 Гр). Частота объективного ответа, оцениваемая с помощью критериев оценки ответа при солидных опухолях (RECIST), варьировалась от 49% до 72%, и частота повышалась с большей степенью лимфодеплеции.Полная регрессия опухоли наблюдалась у 20 из 93 пациентов (22%), и этот ответ продолжался от 37 до 82 месяцев у 19 пациентов [61]. Устранение супрессорных Т-клеток или уменьшение эндогенных лимфоцитов, которые могут конкурировать за гомеостатические регуляторные цитокины, такие как IL-7 или IL-15, может быть причиной лимфодеплеции хозяина для увеличения функциональности TIL [62, 63]. Несмотря на этот обнадеживающий результат, ACT с TIL имеет ряд очевидных недостатков. Во-первых, это дорого и требует много времени. Во-вторых, CD4 + CD25 + T-клетки (Treg-клетки) в TIL могут подавлять противоопухолевый ответ, а IL-2 в культуральной среде может стимулировать рост Treg-клеток [64].В-третьих, только около 50% процентов меланом воспроизводят противоопухолевые TIL, в то время как многие другие типы рака редко содержат достаточно опухолево-реактивных лимфоцитов для идентификации и увеличения TIL [65–67]. Наконец, лимфодеплеция требует улучшения физического состояния пациентов. Новые достижения в иммунологии предоставят более практические подходы к повышению клинической эффективности TIL. Например, замена IL-2 на IL-7 и IL-15 может эффективно предотвратить пролиферацию Treg [68]. С другой стороны, моноклональный даклизумаб против CD25 может вызывать длительное истощение CD25 (+) Treg [69, 70].

Помимо цитокинов, химические вещества в культуральной среде также могут влиять на функцию Т-клеток после трансплантации. Например, обработанные рапамицином Т-клетки приобретают антиапоптотический и устойчивый к рапамицину фенотип, что приводит к лучшей персистенции in vivo после трансплантации [71].

4.2. Генетически модифицированная Т-клетка

Чтобы преодолеть вышеупомянутые ограничения, был разработан другой подход, основанный на генетической модификации аутологичных лимфоцитов от больных раком.Функции Т-клеток могут быть значительно улучшены с помощью генетических модификаций, таких как подавление активности агониста смерти (BID) взаимодействующего домена (BID) [72, 73] или повышение уровня BCL-XL и BCL-2 [74, 75], вставка мутантного гена CTLA4. [76], трансфекция человеческого гена c-fms для ответа на колониестимулирующий фактор-1 (CSF-1) [77], трансдукция хемокинового рецептора CXC типа 2 (CXCR2), CC-хемокинового рецептора типа 4 (CCR4) или CCR2B для лучшей миграции [78] и модификации для экспрессии химеры PD1-CD 28 для преодоления иммунной супрессии [79].Кроме того, Т-клетки могут быть оснащены генами, кодирующими рецепторы, способные распознавать специфический для рака антиген.

Существует два типа противоопухолевых рецепторов: один — это природные Т-клеточные рецепторы (TCR), а другой — химерные антигенные рецепторы (CAR). TCR представляет собой гетеродимер α, — и β -цепей, которые распознают антигенные пептиды, представленные молекулами MHC, в то время как антигены-мишени CAR не ограничиваются MHC через одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) [80].

Гены Т-клеточных рецепторов могут быть получены из эффективных TIL [65] у пациентов с меланомой или трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий MHC [81]. Кроме того, бактериофаги могут генерировать опухолеспецифические гены TCR [82]. Затем Т-клетки трансдуцируют ретровирусом или вектором Lentivirus , содержащим гены TCR для распознавания TAA. Морган и его коллеги достигли первого успеха, применив Т-клетки, трансдуцированные TCR, которые нацелены на MART-1 (дифференцирующий антиген меланоцитов / меланомы), у 15 пациентов с прогрессирующей метастатической меланомой.Среди них 2 пациента показали объективный ответ (1 пациент с полным ответом и 1 пациент с частичным ответом) с устойчивыми уровнями сконструированных Т-клеток (от 20% до 70%) через 1 год после инфузии [83]. Хотя скорость ответа в этом небольшом испытании оказалась ниже, чем в испытании TIL ACT [61], применение модифицированных геном TCR Т-клеток оказалось эффективным и было распространено на другие виды солидного рака, такие как саркома синовиальных клеток, колоректальный рак и рак почек. клеточная карцинома в клинических исследованиях [67, 81, 84, 85].

Выбор опухолеспецифических антигенов кажется решающим. В последующем исследовании TCR, распознающих антигены MART-1 и gp100h на меланомах, сообщалось о токсичности на мишени, такой как витилиго, увеит и слуховая токсичность из-за низкого уровня экспрессии MART-1 и gp100h на нормальных меланоцитах [67]. Кроме того, распознавание неродственного пептида, экспрессируемого неродственным белком, экспрессируемым сердечными миоцитами, вызывало тяжелую сердечно-сосудистую токсичность [86]. Следовательно, самая большая проблема — найти ТАА, не экспрессирующиеся в нормальных тканях.Раковые антигены семенников являются многообещающими мишенями, поскольку они экспрессируются в различных эпителиальных раках и семенниках, а не в нормальных тканях взрослого человека, а отсутствие молекул MHC класса I предотвращает повреждение семенников, вызванное Т-клетками. В клиническом исследовании по оценке клинической эффективности аутологичных Т-клеток, трансдуцированных TCR, против NY-ESO-1 (один антиген рака яичка) для лечения пациентов с метастатической синовиально-клеточной саркомой и меланомой, объективные частичные ответы были достигнуты у 4 из 6 пациентов с синовиально-клеточная саркома и 5 из 11 пациентов с метастатической меланомой.Важно отметить, что ни один из пациентов не проявил токсичности в отношении мишени [86]. Помимо NY-ESO-1, исследуются другие антигены рака яичка, такие как MAGE-A3 и SSX2.

Однако у Т-клеток, модифицированных геном TCR, есть некоторые недостатки. Цепи α, — и β введенных TCR могут неправильно спариваться с соответствующими цепями эндогенных TCR, что значительно снижает экспрессию TCR на поверхности трансдуцированных Т-клеток, что способствует снижению противоопухолевой эффективности. Творческий подход к уменьшению ошибочного спаривания — введение трансгена, кодирующего малую интерферирующую РНК или нуклеаз цинкового пальца, для подавления эндогенного TCR [87, 88].Кроме того, природа функции TCR, ограниченная MHC, делает возможным, что опухоль может ингибировать распознавание антигенов Т-клетками путем подавления экспрессии MHC [89]. По той же причине TCR могут реагировать только на пептиды, представленные молекулами MHC, и не могут быть направлены на углеводные и гликолипидные антигены.

В отличие от TCR, ЦАР могут преодолеть эти препятствия. CAR представляют собой рецепторы иммунитета, созданные с помощью генной инженерии, которые связывают специфические антигены, экспрессируемые на поверхности раковых клеток, а затем активируют Т-клетки для уничтожения опухолевых клеток [90].Как правило, CAR состоит из внеклеточного TAA-специфичного вариабельного фрагмента одноцепочечного антитела (scFv), молекулярной шарнирной области, трансмембранных доменов и внутриклеточных сигнальных доменов. Вариабельный фрагмент одноцепочечного антитела может нацеливаться на опухолевые антигены без ограничения MHC; поэтому метод может применяться ко всем людям независимо от их типа HLA, а также может распознавать углеводные и гликолипидные антигены [91, 92]. Трансмембранные домены участвуют в димеризации CAR и активации Т-клеток.Самым большим преимуществом CAR перед TCR является то, что CAR может распознавать TAA без ограничений MHC. Более того, NK-клетки [93] и CIK-клетки также могут быть модифицированы CAR. Первое поколение CAR состоит из scFv и ITAM (иммунорецепторный тирозиновый мотив активации). Хотя возможность использования CARs-экспрессированных Т-клеток была доказана первоначальными экспериментами [94], временная пролиферация Т-клеток и низкий уровень секреции цитокинов сделали противоопухолевую активность Т-клеток неустойчивой. Второе поколение CAR было сконструировано путем включения костимулирующих доменов, таких как CD28, CD27, CD134, CD137, CD244, индуцибельной костимуляции (ICOS) и С-концевой киназы SRC лейкоцитов (LCK) во внутриклеточный сигнальный домен [95 , 96].Несколько исследований продемонстрировали, что CAR второго поколения усиливают функцию и персистентность Т-клеток, увеличивая индуцированную антигеном продукцию цитокинов и повышая регуляцию антиапоптотических белков, что приводит к лучшему уничтожению сформировавшихся опухолей [95, 97–102]. CAR третьего поколения были разработаны для включения дополнительных костимулирующих сигнальных доменов (например, CD28 / 4-1BB / CD3 ζ , CD28 / OX-40 / CD3 ζ ), которые дополнительно улучшают полные сигнальные возможности Т-клеток. [103, 104].

Первое захватывающее клиническое испытание с использованием CAR было проведено Pule в 2008 году. Они вылечили 11 пациентов с нейробластомой с помощью сконструированных CTL, специфичных к вирусу Эпштейна-Барра (EBV), экспрессирующих рецептор химерного антигена, направленный против дизиалоганглиозида GD2. Некроз опухоли или регресс, даже стойкая полная ремиссия, наблюдались у 4 из 8 пациентов с опухолями, подлежащими оценке [105]. Однако наиболее впечатляющее и успешное достижение было зарегистрировано у пациента с В-клеточной лимфомой, которого лечили Т-клетками, экспрессирующими CAR, направленными на белок клеточной поверхности CD19.CD19 ограничен нормальными зрелыми В-клетками, злокачественными В-клетками, предшественниками В-клеток и плазматическими клетками [106, 107]. Пациент пережил резкий регресс лимфомы [108]. В другом обнадеживающем клиническом исследовании 8 пациентов с запущенными В-клеточными злокачественными новообразованиями лечились химиотерапией с последующим введением Т-лимфоцитов, трансдуцированных анти-CD19-CAR, и курсом ИЛ-2. У шести из 8 пациентов была достигнута объективная ремиссия, в то время как у всех пациентов были клетки, содержащие ген анти-CD19 CAR, циркулирующий в крови [109].В настоящее время применение CAR распространилось на различные виды рака, такие как ХЛЛ (хронический лимфолейкоз) [110], ОЛЛ (острый лимфобластный лейкоз) [111], неходжкинская лимфома [111], острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) [112]. ], почечно-клеточный рак (ПКР) [113], колоректальный рак [94] и рак яичников [114].

К сожалению, использование Т-клеток, созданных с помощью CAR, имеет несколько побочных эффектов. Морган сообщил, что у пациента с метастатическим раком толстой кишки возникла острая дыхательная недостаточность после инфузии Т-клеток, трансдуцированных химерным антигеном рецепторами против ErbB2, и он умер через пять дней.Причина подозрения заключалась в том, что модифицированные Т-клетки распознают ERBB2, экспрессируемый нормальными клетками легких, и секретируют воспалительные цитокины, такие как TNF- α и IFN- γ , вызывая легочную токсичность и синдром полиорганной дисфункции [115].

Статус дифференцировки Т-клеток — большая проблема для максимизации противоопухолевого эффекта Т-клеток. Гаттинони и его коллеги открыли подмножество Т-клеток памяти человека с подобными стволовыми клетками свойствами, названных стволовыми клетками памяти (TSCM), которые могут опосредовать превосходные противоопухолевые реакции, чем центральные Т-клетки памяти (TCM) и эффекторные Т-клетки памяти (TEM) в организме человека. гуманизированная модель мыши [116].Более слабодифференцированные Т-клетки обладают лучшей пролиферативной способностью и противоопухолевым действием in vivo [117]. С другой стороны, гемопоэтические стволовые клетки также являются идеальным типом для обеспечения длительного приживления. Человеческие CD34 + стволовые клетки могут быть выделены из периферической крови и генетически модифицированы опухолеспецифическими рецепторами. Эти клетки вводили гуманизированным мышам и генерировали значительную популяцию специфичных для меланомы Т-клеток, которые могут сохраняться длительное время in vivo [118].

5.Выводы и перспективы

По сравнению с другими стандартными методами лечения, такими как химиотерапия, лучевая терапия и хирургия, иммунотерапия может обеспечить целенаправленное лечение благодаря высокоспецифическому взаимодействию белок / рецепторный белок. Активированные или сконструированные иммунные клетки могут попасть в раковые ткани, чтобы вызвать стойкий противоопухолевый иммунный ответ. Большинство текущих клинических испытаний подтвердили многообещающую, хотя и умеренную клиническую эффективность. Однако сочетание иммунотерапии или других традиционных методов лечения, таких как химиотерапия и лучевая терапия, показало потенциал доклинических исследований, предполагающих синергетический эффект на ответ опухоли и общую выживаемость [119–122].Кроме того, остается проблемой определить оптимальную дозу и схему комбинированной терапии для достижения максимальной клинической эффективности. Интригующая перспектива состоит в том, что иммунотерапия займет важное место и станет стандартным методом лечения рака.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана 973 проектами MOST (№ 2012CB26600) и ключевыми инновационными группами науки и технологий в провинции Чжэцзян (2012R10046-12).

Технология переноса клеток для тканевой инженерии | Воспаление и регенерация

Недавний прогресс в тканевой инженерии сделал возможным лечение различных заболеваний с использованием клеток, размноженных ex vivo [1]. Возможность клеточной терапии многих заболеваний широко изучается. Выбор методов культивирования клеток, которые способствуют терапевтическому эффекту клеток, и методов трансплантации, которые включают идеальный носитель для локальной трансплантации, являются важными соображениями в клеточной терапии [2].Мы разработали новый метод трансплантации клеток, «технологию переноса клеток», с использованием фотолитографии, которая часто используется для формирования микротекстур в производстве и печати полупроводников [3]. Эта технология позволяет нам переносить культивируемые клетки на материал каркаса, например картинки и буквы, напечатанные на бумаге. Мы исследовали возможность этого нового метода клеточной терапии с использованием нескольких моделей заболеваний. В этом обзоре мы обрисовываем в общих чертах методы клеточной терапии, о которых мы сообщали до сих пор, с использованием техники переноса клеток.

Перенос клеток с использованием фотолитографии

Фотолитография — это слово с приставкой «фото», означающей свет, к «литографии», которое происходит от литографии. Буквально среди различных литографических методов фотолитография использует узор, сделанный светом для копии документа. Благодаря своей точности, воспроизводимости и массовой производительности фотолитография широко используется в прецизионном машиностроении и полиграфии. Фотолитография состоит в основном из двух этапов, а именно: нанесение желаемого рисунка на подложку и «перенос» рисунка на поверхность изделия.

Мы разработали «технологию переноса клеток», которая позволяет переносить культивируемые клетки на поверхность трансплантационного каркаса. На рисунке 1 показана схематическая диаграмма процесса переноса клеток с помощью технологии переноса клеток. Сначала мы нанесли тонкий слой тетраэтиленгликоля (ТЭГ) или полиэтиленгликоля (ПЭГ) на стеклянную подложку. Затем мы нанесли фотошаблон на слой ТЭГ / ПЭГ и подвергли его воздействию ультрафиолета. Ультрафиолетовое облучение частично разрушает цепь ТЭГ / ПЭГ и приводит к разнице в длине оставшейся цепи ТЭГ / ПЭГ между фото-маскированной и немаскированной поверхностью.Оставшаяся длина TEG / PEG проявляется как разница между гидрофильностью и гидрофобностью поверхности субстрата. Это различие связано с силой адгезии клеток к поверхности субстрата (рис. 2). Область с разрушенным ТЭГ / ПЭГ является клеточным адгезивом, а область с сохраненным ТЭГ / ПЭГ посредством фотошаблона не является адгезивной. Используя эту разницу в гидрофильности / гидрофильности, можно прикреплять клетки к субстрату в соответствии с различными рисунками, полученными с помощью фотошаблонов. Рисунок 1b демонстрирует меченные PKh36 остеобласты, прикрепленные к субстрату с сетчатым рисунком.После адгезии клеток к субстрату субстрат помещали на материал каркаса, обеспечивая прямой контакт поверхности клетки с каркасом. Спустя 18-24 ч клетки переносили на каркас после удаления субстрата. Субстрат для переноса легко удалялся с каркаса без какого-либо воздействия на клетки. На этом этапе сила адгезии субстрат-клетка должна быть меньше, чем адгезия между носителем и клетками. Это можно контролировать с помощью силы и продолжительности УФ-облучения поверхности ТЭГ / ПЭГ после маскирования.Скорость деградации PEG / TEG может быть оптимизирована, чтобы максимизировать эффективность передачи ячеек. После удаления субстрата для переноса с каркаса клетки переносили на поверхность каркаса и затем были готовы к трансплантации.

Рис. 1

Схема технологии передачи клеток. a Процедура технологии переноса клеток от создания субстрата для переноса клеток до переноса клеток. Слой ТЭГ / ПЭГ (желтый) сформирован на стеклянной подложке. После нанесения рисунка (фотошаблон: красный) на подложку излучается ультрафиолетовый свет.Поверхность, подверженная воздействию ультрафиолетового излучения, становится областью слипания ячеек (зеленая). Через несколько часов инкубации после посева клеток на субстрат клетки переносят на каркас (розовый) путем прямого контакта субстрата с каркасом. Через 18-20 ч клетки переносят на каркас. b Осеобласты переносили с использованием субстрата для переноса клеток с сетчатым рисунком. Бар = 100 мкм

Рис. 2

Неклейкая и клейкая поверхность на подложке для переноса клеток.Цепи ТЭГ / ПЭГ разрушаются УФ-облучением. Маскированная поверхность с сохраненным слоем ТЭГ / ПЭГ гидрофобна и не прилипает к клеткам. Немаскированная область, где разрушается ТЭГ / ПЭГ, является гидрофильной и клеточной адгезивной

Для покрытия поверхности переводной подложки мы сначала покрыли стеклянную пластину фторалкилсиланом (FAS). Однако из-за более низкой стабильности формирования рисунка на субстрате FAS был заменен на PEG / TEG. Мы наблюдали более длительную стабильность рисунков, сделанных с использованием ПЭГ / ТЭГ на подложке, по сравнению с рисунками, полученными с помощью FAS.Время, необходимое для переноса клеток, также оказалось короче для субстрата ПЭГ / ТЭГ, чем для ФАС.

Амнион как каркас

Используя технологию переноса клеток, клетки, размноженные ex vivo, были перенесены на материалы каркаса, включая гидрогели. Среди них мы использовали амнион, часть амниотической мембраны, в качестве материала каркаса для переноса клеток из-за его эластичности, гибкости и высокой степени успешности переноса клеток. Амниотическая мембрана — это биологическая мембрана, образующая амниотический мешок, который удерживает и защищает околоплодные воды и эмбрион внутри [4].Амниотическая оболочка могла быть получена во время родов; однако от него вообще отказываются. Мембрана состоит из амниона и хориона [5]. Амнион — это внутренний слой амниотической оболочки. Амнион использовался для лечения кожных ожогов и изъязвлений, некроза и серьезного воспаления глаз в качестве перевязочного материала, благодаря его антимикробным и антифиброзным свойствам [6, 7]. Мы изолировали амнион из оболочки яйца путем удаления хориона, а компоненты клеток были удалены из амниона обработкой под высоким гидростатическим давлением [8, 9].Полученный децеллюризованный амнион использовали для переноса клеток. Учитывая клиническое применение, необходимы дальнейшие оценки для определения безопасности мембраны для человека.

Почти 100% клеток на субстрате для переноса были успешно перенесены на амнион после нескольких часов инкубации. Амнион — отличный материал каркаса для переноса клеток, так как способствует высокой эффективности переноса. Более того, наиболее важной характеристикой амниона при переносе клеток является стабильность перенесенных клеток на мембране [10, 11].Перенесенные клетки на амнионе прочно прикрепляются к поверхности амниона, что позволяет деформировать и обрезать мембрану хирургическими инструментами [10, 11]. Эта уникальная характеристика позволяет легко и надежно трансплантировать клетки.

Узорчатый и многослойный перенос клеток

Одной из примечательных особенностей фотолитографии является точный перенос веществ в соответствии с тонким рисунком, нанесенным на подложку. Воспользовавшись этой уникальной характеристикой фотолитографии, мы можем переносить клетки в любых желаемых формах на каркас.Мы сделали узоры, похожие на капилляры, на стеклянной подложке и попытались сделать капилляры методами тканевой инженерии. Мы высевали эндотелиальные клетки сонной артерии крупного рогатого скота (BCAECs) на субстрат для переноса с капиллярно-подобным постукиванием и переносили их на амнион [12]. BCAECs, перенесенные на амнион, показали капиллярно-подобную структуру, а также с помощью электронной микроскопии было обнаружено, что капилляр состоит из стенки сосуда с помощью BCAEC и просвета внутри. Мы трансплантировали амнион, перенесенный BCAEC, в ушную раковину мыши и обнаружили, что капилляр сохранял свою структуру до 5 дней после трансплантации.Визуализация in vivo продемонстрировала, что капилляр функционирует в ухе мыши-хозяина. Таким образом, можно предположить, что имитация анатомической структуры ткани-мишени до трансплантации может способствовать результатам трансплантации клеток. Микроваскуляризация — хороший пример такого типа трансплантации клеток.

С другой стороны, мы также можем изготовить субстрат для переноса клеток с адгезионными характеристиками для целых клеток. С помощью этого субстрата клетки переносятся на амнион в слоистой структуре.В случае, если для трансплантации клеток требуется количество клеток, а не их расположение, полезен этот пластинчатый материал для трансплантации клеток. Нам удалось перенести клетки и изготовить материалы, похожие на клеточные листы, с использованием различных типов клеток, таких как фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), остеобласты и эндотелиальные клетки [10,11,12,13]. Приблизительно 5 × 10 ⁵ клеток / см ² были перенесены на амнион с использованием технологии переноса клеток. Кроме того, мы перенесли два разных типа ячеек в перекрывающиеся два слоя с помощью технологии передачи ячеек и назвали это «двойной перенос ячеек» [11].Для этого двойного переноса клеток мы культивировали два типа клеток на субстрате для переноса и переносили их с помощью процесса однократного переноса. Этот метод был применим к трем различным типам ячеек, и тройные слои ячеек были успешно изготовлены. Этот множественный перенос клеток может сделать возможным уникальную трансплантацию клеток с учетом трехмерной клеточной структуры и межклеточной коммуникации.

Сообщалось о различных методах формирования клеточного рисунка и клеточного листа. Для формирования клеточного паттерна в основном изучались две модальности.Один из них — использовать специфичность клеточной адгезии к внеклеточному матриксу для размещения клеток, и это может формировать резкие грани узоров [14, 15]. Однако с помощью этого метода сложно формировать паттерны, используя более двух типов ячеек. Другой метод включает использование «силы» для определения местоположения клеток, включая магнитные, электрокинетические и гидравлические силы [16,17,18]. Эти методы позволяют манипулировать большим количеством клеток, но некоторые из них требуют маркировки клеток и могут повлиять на жизнеспособность клеток.Использование термочувствительных полимеров было изучено и описано для формирования клеточного листа [19]. Клеточные листы, изготовленные с помощью этого метода, слишком хрупкие, чтобы напрямую манипулировать ими с помощью хирургических инструментов. Наш метод генерирует клеточный лист путем переноса одного клеточного слоя на поверхность каркаса и обеспечивает физическую прочность, которая обеспечивает стабильную трансплантацию клеток.

Трансплантация клеток с использованием технологии переноса клеток на животных моделях

Ишемическая сосудистая болезнь

Ишемические сосудистые заболевания, включая инфаркт миокарда, инфаркт мозга и эмболию периферических артерий, развиваются из-за отсутствия кровотока из-за закупорки артерии и вен [ 20, 21].Для восстановления кровотока при этих заболеваниях выполнялась операция по шунтированию артерии или чрескожная эндоваскулярная ангиопластика [22, 23]. В последнее время во многих исследованиях сообщается, что ишемические состояния улучшаются путем инъекции или трансплантации различных типов культивируемых клеток, включая мононуклеарные клетки костного мозга, гемопоэтические стволовые клетки, эндотелиальные клетки сосудов и эндотелиальные клетки-предшественники [24, 25]. Мы изготовили амнион, перенесенный из эндотелиальных клеток, с использованием субстрата для переноса с формированием капиллярного паттерна и изучили его возможность для лечения ишемических заболеваний, трансплантировав его на модель ишемии конечностей мыши (рис.3) [12]. Реперфузия ишемизированной конечности наблюдалась после трансплантации амниона, перенесенного эндотелиальными клетками, при лазерном допплеровском кровотоке, улучшились некроз нижней конечности и нарушение походки. Пересаженный капилляр слился с сосудистыми сетями хозяина и начал функционировать через 5 дней после трансплантации. Эта трансплантация капилляров является промежуточным методом между обычным шунтированием и трансплантацией клеток и может быть новым вариантом лечения ишемической болезни. Чтобы сделать более стабильным трансплантируемый капилляр, изучаются некоторые модификации, такие как образование капилляра эндотелиальных клеток с настенными клетками.

Рис. 3

Схема трансплантации клеток методом клеточного переноса. Клетки переносятся на поверхность амниона с использованием либо формирования рисунка, либо субстрата для послойного переноса клеток. Перенесенный амнион обрезается и трансплантируется животным моделям, таким как ишемия-реперфузия, дефект свода черепа и модель дефекта пародонта

.

Костный дефект

Для костных дефектов, вызванных резекцией и переломом опухоли, были исследованы различные стратегии лечения, включая местное применение фактора роста с костеобразующей активностью, такого как костные морфогенетические белки, и трансплантация аутологичных или аллогенных костных трансплантатов и искусственных заменителей кости. такие как гидроксиапатит и бета-трикальцийфосфат [26, 27].Недавно был предложен терапевтический потенциал трансплантации клеток при костном дефекте, и сообщалось о регенерации костного дефекта при трансплантации МСК и остеобластов [28, 29]. Мы сделали субстрат для переноса со всей адгезивной поверхностью клетки и перенесли остеобласты мыши (Kusa-A1) на амнион (рис. 3) [13]. Был создан костный дефект свода черепа мыши, и перенесенный остеобластом амнион был помещен, чтобы закрыть дефект. Приблизительно 7,8 × 10 ⁴ клеток трансплантировали на каждый дефект.Через 5 недель наблюдалось полное закрытие костного дефекта в дефекте, трансплантированном остеобластами, в то время как контрольный дефект не показал заживления. По сравнению с другими тестовыми группами, включающими инъекцию остеобластов, только трансплантацию амниона и отсутствие лечения, в дефектах амниона, перенесенных остеобластами, была обнаружена значительная регенерация кости. Пересаженные остеобласты были обнаружены вокруг вновь сформированной кости через 5 недель после операции, и предполагается, что эти остеобласты непосредственно участвуют в регенерации кости.Прочная адгезия остеобластов к амниону может способствовать более длительному удержанию клеток в костных дефектах и ​​заметной регенерации кости, наблюдаемой при трансплантации остеобласт-амнион по сравнению с таковой при инъекции клеток. Эти результаты предполагают терапевтический потенциал амниона, перенесенного остеобластами, для лечения костного дефекта. Мы также наблюдали улучшение заживления костей при трансплантации амниона с двойным переносом клеток, созданного с использованием остеобластов и МСК из периодонтальной связки (стволовые клетки периодонтальной связки, PDLSC) [11].Мы перенесли первичные остеобласты человека и PDLSC на амнион, чтобы сформировать слои остеобластов-PDLSC на мембране, и трансплантировали их в модель дефекта кости черепа мыши. Через восемь недель после трансплантации мы наблюдали усиление регенерации костной ткани в дефектах после трансплантации остеобластов и PDLSC по сравнению с дефектами после трансплантации отдельных клеток (остеобласты или только PDLSC). Эти результаты предполагают клиническую осуществимость технологии переноса клеток при регенерации кости.

Дефект пародонта

Заболевание пародонта характеризуется хроническим воспалением и разрушением опорных тканей зуба, включая кости, периодонтальные связки и цемент, в основном из-за инфекции грамотрицательных бактерий [30].Традиционные методы лечения пародонта заключаются в механическом удалении бактериальных факторов, что приводит к уменьшению воспаления и стабильности статуса заболевания [31]. Однако восстановления опорных тканей зуба, утраченных по мере прогрессирования заболевания, практически не наблюдалось. Хотя клинически применялись несколько регенеративных подходов, достаточная регенерация еще не была достигнута. Недавно было продемонстрировано, что трансплантация клеток эффективна для регенерации тканей пародонта, включая кости, периодонтальные связки и цемент, с использованием MSC костного мозга, MSC жировой ткани, PDLSC и клеток, происходящих из надкостницы [32].Мы создали модель дефекта пародонта, удалив кость, цемент и периодонтальную связку из моляра верхней челюсти крысы и трансплантированных клеток с использованием технологии клеточного переноса (рис. 3) [10]. В качестве типа клеток для трансплантации мы выбрали PDLSC, потому что было показано, что они обладают способностью дифференцироваться в различные клетки, такие как остеобласты, адипоциты, хондроциты и цементобласты [33]. Мы исследовали регенеративный потенциал амниона, перенесенного из PDLSC (PDLSC-амнион), путем трансплантации его в хирургически созданный дефект пародонта и сравнили с дефектом, трансплантированным только амнионом.После 4 недель периода заживления наблюдалась усиленная регенерация тканей пародонта в дефектах, пересаженных PDLSC-амнионом. На гистологических срезах наблюдали недавно регенерированный цемент, периодонтальную связку и кость. Эти результаты предполагают, что трансплантация PDLSC-амниона может быть новым методом пародонтальной регенеративной терапии.

Горизонтальный перенос генома путем перемещения целых органелл от клетки к клетке

ВВЕДЕНИЕ

Натуральные трансплантаты широко распространены у растений ( 1 — 3 ), и наблюдение за естественной прививкой, вероятно, вдохновило развитие методов прививки в сельском хозяйстве и садоводство ( 4 , 5 ).До недавнего времени считалось, что, хотя белки и молекулы РНК могут перемещаться от привоя к подводу, обмен генетической информацией через соединение трансплантата не происходит. Генетические эксперименты поставили под сомнение эту догму, продемонстрировав, что целые геномы мигрируют от привоя к подводу ( 6 — 9 ). Все три генома растительной клетки могут участвовать в горизонтальном переносе генома между привитыми растениями. Этот процесс имеет большое эволюционное значение в том, что он, вероятно, объясняет многие случаи захвата органелл ( 10 — 13 ) и обеспечивает прямой бесполый механизм видообразования посредством аллополиплоидизации ( 9 ).У животных и людей перенос митохондриальных геномов от клетки к клетке восстанавливает канцерогенный потенциал раковых клеток с дисфункциональными митохондриями ( 14 — 16 ) и способствует восстановлению нервной ткани в головном мозге после повреждения, вызванного инсультом ( 17 ).

Как геномы физически передаются от клетки к клетке и перемещаются ли они в виде свободных молекул ДНК или инкапсулированы в органеллы, в настоящее время полностью неизвестно. Чтобы выяснить механизм горизонтального переноса генома, мы изучили клеточные события во время формирования соединения трансплантата и попытались наблюдать перенос генома от клетки к клетке в режиме реального времени.

ОБСУЖДЕНИЕ

Генетические данные показали, что ядерный, пластидный и митохондриальный геномы передаются бесполым путем между клетками и организмами одного или разных видов ( 6 — 9 , 14 , 15 , 17 ). У растений горизонтальный перенос пластидных или митохондриальных геномов приводит к растениям с новыми комбинациями ядерных и органеллярных геномов, в то время как горизонтальный перенос ядерных геномов генерирует новые виды растений, которые являются аллополиплоидными ( 9 ).В этой работе мы выяснили клеточные механизмы, лежащие в основе горизонтального переноса пластидных геномов. По сравнению с ядрами и митохондриями пластиды предлагают несколько преимуществ для изучения механизмов горизонтального переноса генома. Во-первых, в отличие от митохондрий, пластиды обычно не сливаются и не рекомбинируют, что позволяет проследить судьбу отдельных органелл. Во-вторых, пластиды можно трансформировать генетически, облегчая экспрессию флуоресцентного белка внутри органеллы.Наконец, по сравнению с ядром, из которого флуоресцентные репортерные белки обычно просачиваются в цитозоль [и потенциально могут быть поглощены горизонтально приобретенным вторым ядром ( 7 )], репортерные белки, экспрессируемые пластидой, остаются внутри пластиды, таким образом делая Мечение органелл однозначно. Исследования, представленные здесь, демонстрируют, что горизонтальный перенос генома происходит за счет переноса целых органелл от клетки к клетке с геномами, инкапсулированными в них. Наши микроскопические исследования выявили замечательную серию событий, связанных с перемещением пластид между растениями через соединение трансплантата.Первоначальное образование недифференцированной каллусной ткани сопровождается заметными изменениями в структуре клеточной стенки, в первую очередь образованием крупных пор. Цитоплазматический материал проходит через эти поры, в конечном итоге соединяя соседние клетки и облегчая прохождение крупных клеточных структур. В то же время пластиды претерпевают заметные изменения в своей морфологии и становятся очень подвижными (рис. 8A и фильмы S1 и S2). Дедифференцировке и повышенной подвижности, вероятно, дополнительно способствует индукция местного голодания, которое при (естественной или экспериментальной) трансплантации может быть непосредственным следствием ранения и разрыва сосудистых пучков.Мы могли наблюдать прохождение пластид от клетки к клетке и через соединение трансплантата в режиме реального времени (рис. 8B и видеоролики S3 – S5), что в конечном итоге подтвердило, что органеллы размером с целые пластиды могут перемещаться между клетками. размышлять о возможных физиологических функциях пор, образующихся в клеточных стенках соседних клеток. Формирование пор может быть начальной стадией биогенеза вторичных плазмодесм ( 26 , 34 ) или, альтернативно, может быть частью реакции голодания, поскольку поры способствуют обмену питательных веществ между маткой и привоем перед повторным соединением сосудов и образование вторичных плазмодесм на стыке трансплантата.

В то время как в предыдущих отчетах отбор антибиотиков использовался для обнаружения событий горизонтального переноса генома, отбор не использовался ни в одном из микроскопических исследований сращений трансплантатов в нашем настоящем исследовании. Этот факт важен тем, что демонстрирует, что высокочастотное перемещение пластид от клетки к клетке происходит также в отсутствие отбора для переноса генома.

События начального горизонтального переноса генома ограничиваются клетками в соединении трансплантата. Тем не менее, эти события могут легко передаваться по наследству из-за инициации бокового побега из места пересадки.Поскольку прививка включает в себя ранение, а ранение вызывает локальный синтез фитогормона ( 24 , 35 , 36 ), разрастание боковых побегов является обычным явлением как в естественных, так и в искусственных трансплантатах ( 7 ). Стереотипно изображаемые как чечевицеобразные эллипсоидные органеллы, был описан широкий спектр типов пластид и связанных морфологий ( 37 ). В дополнение к разнообразию форм, которые могут принимать, в частности, незеленые типы пластид ( 37 , 38 ), пластиды также могут образовывать выступы (стромулы), которые являются очень динамичными и дополнительно влияют на морфологию (и подвижность) пластид за счет их взаимодействия с цитоскелет ( 30 , 31 , 39 — 41 ).Наше наблюдение, что пластиды в клетках каллуса в местах соединения трансплантата принимают множество альтернативных форм и, кроме того, становятся очень подвижными, согласуется с мнением о том, что, по крайней мере, при определенных условиях морфология и поведение пластид очень динамичны. способность тканей к трансплантату представляет собой активную программу развития. У семенных растений это включает (i) рост каллюса в месте прививки, (ii) установление новых сосудистых связей между привоем и подвоями и (iii) образование межклеточных связей de novo путем образования вторичных плазмодесм ( 5 , 26 , 42 ).Последний требует местного удаления клеточной стенки ( 26 ) и, вместе с индукцией роста каллуса, может непосредственно участвовать в облегчении подвижности органелл. Хотя до сих пор горизонтальный перенос генома был показан только в контексте прививки, вторичные плазмодесмы также часто вставляются в существующие клеточные стенки между неделящимися клетками в интактных тканях растений ( 34 ). В будущем будет интересно исследовать, происходит ли перемещение органелл от клетки к клетке при образовании вторичных плазмодесм в листьях, цветках и других тканях.

Кажется возможным, что горизонтальный перенос ядерных и митохондриальных геномов использует аналогичные клеточные механизмы, обнаруженные здесь для пластид. Однако в настоящее время нельзя исключать привлечение альтернативных (или дополнительных) механизмов. Например, частичное слияние клеток (например, слияние клеточного зачатка с соседней клеткой в ​​месте соединения трансплантата) также может переносить органеллы от одной клетки к другой и может быть привлекательной возможностью для исследования, особенно для горизонтального движения ядер (которое намного больше, чем пластиды, которые мы наблюдали, перемещаясь от клетки к клетке в этой работе).Вышеупомянутые технические препятствия затрудняют исследование механизма горизонтального переноса генома в ядрах и митохондриях.

В дополнение к трансплантатам, горизонтальный перенос ДНК также происходит между паразитическими растениями и их растениями-хозяевами ( 13 , 43 , 44 ). В связи с этим важно понимать, что установление гаусториальных связей между паразитом и хозяином механически очень похоже на прививку ( 45 ), что делает вероятным, что аналогичные клеточные механизмы, описанные здесь, также участвуют в процессах горизонтального переноса ДНК, опосредованных паразитизмом растений-растений.

Таким образом, результаты, представленные здесь, прояснили клеточные механизмы, которые лежат в основе событий горизонтального переноса генома в трансплантатах растений, и раскрыли ранее неизвестный путь межклеточного транспорта, с помощью которого очень большие клеточные структуры (включая целые пластиды) обмениваются между клетками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал

Стерильный табак ( Nicotiana tabacum сорт Petit Havana и сорт Samsun NN) выращивали на отвержденной агаром синтетической среде, содержащей сахарозу (30 г / л) ( 46 ).Гомоплазматическая пластида-трансформированная (транспластомная) Pt-spec: растения dsRed были предоставлены S. Schillberg (Fraunhofer IME, Aachen) и несут кассету экспрессии dsRed (управляемую промотором оперона рибосомной РНК и химерной 5′-нетранслируемой областью из хлоропласта ). psbA и clpP ), который был вставлен в качестве дицистронного оперона с геном селектируемого маркера aadA ( 47 ) в межгенную область между генами rpl32 и trnL в геноме пластиды табака (рис.S1A). Ядерные трансгенные линии Nuc-kan: YFP несут кассету экспрессии YFP под контролем промотора и терминатора 35S CaMV ( 6 ). Растения Nuc-kan: YFP устойчивы к канамицину и демонстрируют накопление YFP ​​в цитозоле и ядре, в то время как растения Pt-spec: dsRed устойчивы к спектиномицину и демонстрируют накопление dsRed в хлоропластах.

Прививка и отбор для межклеточного переноса генома

Чтобы исключить влияние патогенов или эндофитов, эксперименты по прививке проводили с растениями, выращенными в асептических условиях, как описано ранее ( 6 , 7 , 18 ).Подвою и привоям давали возможность слиться с последующим либо микроскопическим анализом, либо отбором для переноса генома путем воздействия на вырезанные участки трансплантата двойной селекции на среде для регенерации растений, содержащей спектиномицин (500 мг / литр) и канамицин (250 мг / литр) ( 6 ). В качестве контроля стеблевые черенки и листовые эксплантаты из растений Nuc-kan: YFP и Pt-spec: dsRed, выращенных в идентичных условиях, подвергали воздействию одной и той же среды. Каллусы и побеги с двойной устойчивостью переносили на свежие чашки и снова регенерировали при селекции антибиотиков для выделения линий переноса гомоплазматического генома ( 18 , 19 ).Регенерированные побеги укореняли на безгормональной среде, переносили в почву и выращивали до зрелости в стандартных тепличных условиях.

Прививка каллуса

Для трансплантации каллусной ткани междоузлия стерильных растений табака (с диаметром стебля приблизительно от 3 до 5 мм) разрезали на диски толщиной от 1 до 2 мм и инкубировали на среде для регенерации в течение 3 дней. Ткань каллуса, пролиферирующая из камбиального кольца, была собрана и использована для трансплантации. Прививку каллуса проводили путем помещения образцов каллуса вместе в узкий зазор между синтетической средой, отвержденной агаром, подходящей для прямой конфокальной визуализации, или непосредственно в алюминиевые носители, подходящие для замораживания под высоким давлением.В альтернативном подходе стержневые диски были пересажены с использованием аналогичной установки. Клетки на границе между тканями обычно прикреплялись в течение 24 часов. Для выделения событий стабильного горизонтального переноса генома трансплантированную каллусную ткань переносили на двойной отбор, как описано ранее ( 6 ).

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Субклеточную локализацию флуоресценции dsRed и YFP определяли с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (TCS SP5 или TCS SP8, Leica, Wetzlar, Германия) с использованием аргонового лазера для возбуждения (512 нм) и 520-560 нм. -нм фильтр для обнаружения флуоресценции YFP, твердотельный лазер с диодной накачкой на длине волны 561 нм для возбуждения и фильтр от 575 до 603 нм для обнаружения флуоресценции dsRed.Флуоресценцию хлорофилла контролировали возбуждением гелий-неоновым лазером на 633 нм или диодным лазером на 405 нм и детектированием с помощью фильтра 650-700 нм.

Окрашивание клеточной стенки in vivo

Для окрашивания клеточных стенок каллусную ткань погружали в 0,01% (мас. / Об.) Калькофлуор (флуоресцентный отбеливатель 28), растворенный в воде, и окрашивали в течение 10 мин. Впоследствии образцы дважды промывали водой и сразу же использовали для визуализации. Calcofluor возбуждали диодным лазером с длиной волны 405 нм и флуоресценцию регистрировали при длине волны от 415 до 480 нм.

Окрашивание ДНК in vivo

Для окрашивания ДНК образцы каллуса погружали в 0,01% раствор SYBR Green и окрашивали в течение 10 мин. Затем образцы дважды промывали водой в течение 5 мин и затем использовали для визуализации. SYBR Green возбуждали с использованием аргонового лазера на длине волны 488 нм, и флуоресценцию регистрировали при длине волны от 500 до 550 нм.

Замораживание под высоким давлением и замена замораживания

Образцы тканей были заморожены под высоким давлением с использованием прибора Leica HPM100. Для ультраструктурного анализа образцы замораживали в 1% OsO ₄ и 0.1% уранилацетат в ацетоне. Для иммуномечения образцы замораживали в 0,5% уранилацетате в ацетоне и заливали в среду LR White при -20 ° C. Впоследствии образцы подвергали полимеризации в ультрафиолете при -20 ° C.

Просвечивающая электронная микроскопия

Для подготовки образцов для ПЭМ-анализа срезы тканей были вырезаны с использованием ультрамикротома Leica UC-6. Для контрастирования срезы после окрашивания уранилацетатом в метаноле (2% в 50% метаноле) в течение 30 минут с последующей 10-минутной инкубацией в цитрате свинца (окраска по Рейнольдсу).Изображения были получены с помощью ТЕМ Zeiss EM 912 Omega (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

Сканирующая электронная микроскопия окружающей среды

Соединения трансплантатов погружали в жидкий азот и затем переносили в камеру для образцов настольного прибора SEM для окружающей среды (Hitachi TM3030Plus). Изображения получали при 5 кВ с использованием детектора вторичных электронов в высоком вакууме.

Последовательная сканирующая электронная микроскопия с получением срезов

Для ЭМ-анализа S ³ прикрепленные каллусные клетки во встроенных клеточных ансамблях разрезали на ленты последовательных срезов толщиной 70 нм с помощью гистоножа.Затем ленты переносили на покровное стекло, сушили при 70 ° C в течение не менее 5 минут и контрастировали. Затем образцы были закреплены на штырях и визуализированы с помощью JEOL 7500F SEM при 15 кВ и токе зонда 10 пА на рабочем расстоянии 8 мм с использованием детектора обратно рассеянных электронов (BSE). Томографические реконструкции из полученных изображений были получены с использованием пакета обработки изображений Fiji TrakEM2.

Маркировка иммунным золотом для электронной микроскопии

Для маркировки иммунозолотом замороженные и замороженные образцы, внедренные в LR White, разрезали на срезы толщиной 100 нм.Неспецифическое связывание антител снижали инкубацией образцов в блокирующем буфере [забуференный фосфатом физиологический раствор — Твин 20 (PBST), содержащий 2% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% рыбьего желатина; Sigma-Aldrich] в течение 1 часа при комнатной температуре. Антигены были обнаружены путем инкубации в блокирующем буфере, содержащем анти-dsRed (разведение 1: 100, мышь; ChromoTek GmbH, Планег-Мартинсрид, Германия), анти-ClpP (1: 200, кролик; предоставлено А. Кларком, Университет Гетеборга, Швеция), антитела против RbcL (1: 200, кролик; Agrisera, Vännäs, Швеция) или антитела против GLN2 (1: 200, кролик; Agrisera) в течение 1 часа при комнатной температуре.Избыточные антитела удаляли шестью промывками буфером PBST по 3 мин каждая. После гибридизации с срезами связанные первичные антитела выявляли путем инкубации в течение 1 часа в блокирующем буфере, содержащем 10 нМ (для мышей; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) или вторичные антитела, меченные коллоидным золотом 25 нМ (козьи антикроличьи антитела, 1 : 20; AURION, Вагенинген, Нидерланды). После шести промывок PBST и трех промывок бидистиллированной водой в течение 3 минут каждая образцы контрастировали водным 2% уранилацетатом в течение 12 минут и цитратом свинца Рейнольдса в течение 7 минут.

Перенос адоптивных клеток и рецепторы химерного антигена