Законопроект об исключении деятельности НПФ по ОПС из под действия 115-ФЗ внесен в ГД

Об этом сообщают сегодня РИА Новости. Группа депутатов во главе с Анатолием Аксаковым внесла в Госдуму законопроект об исключении деятельности НПФ по обязательному пенсионному страхованию из-под действия закона о противодействии отмыванию преступных доходов, следует из базы данных нижней палаты парламента.

«Таким негосударственным пенсионным фондам не надо будет отчитываться перед Росфинмониторингом об операциях с денежными средствами или иным имуществом, потому что в этом для них особой необходимости нет. Причем Росфинмониторинг сам это поддерживает», — сообщил РИА Новости Аксаков.

С инициативой отмены отчетности НПФ о противодействии финансированию терроризма и легализации доходов, полученных преступным путем, выступали обе саморегулируемые ассоциации на рынке негосударственных пенсионных фондов – АНПФ и НАПФ.

Так, в июне т.г.  АНПФ в очередной раз обратилась к регулятору с предложением вернуться к обсуждению этой проблемы. В результате возобновившейся дискуссии с участием АНПФ и НАПФ регулятор поддержал позицию рынка, что и выразилось в появлении соответствующего законопроекта об отмене отчетности НПФ о противодействии финансированию терроризма и легализации доходов, полученных преступным путем.

Излишняя зарегулированность НПФ в этом вопросе была неоправданной — на практике застрахованные лица не позволяют использовать систему ОПС как механизм противодействия легализации доходов, пояснял ранее «Известиям» необходимость изменений исполнительный директор АНПФ Алексей Денисов.

Во-первых, считает он, средства поступают напрямую через бюджетную систему или граждан, то есть абсолютно легальны. Во-вторых, продолжительный период выплаты накопительной пенсии делает данные виды выплат неприменимыми для противодействия отмыванию доходов. Наконец, НПФ из-за 115-ФЗ «вынужденно несут значительные материальные издержки на организацию массовых рассылок писем». Кроме того, в отличие от банков, НПФ не имеют широких способов воздействия на клиентов по предоставлению им обновленных сведений, соответственно, цели 115-ФЗ не достигаются.

В настоящее время к организациям, осуществляющим операции с денежными средствами или иным имуществом, относятся НПФ, имеющие лицензию на осуществление деятельности по пенсионному обеспечению и пенсионному страхованию. Законопроектом в состав таких организаций предлагается включать НПФ только в части осуществления ими деятельности по негосударственному пенсионному обеспечению.

Риск легализации преступных доходов путем уплаты страховых взносов по обязательному пенсионному страхованию, включая добровольные, отсутствует, так как страховые взносы всегда уплачиваются в Пенсионный фонд РФ (ПФР), отмечается в пояснительной записке к законопроекту. Источники происхождения и поступления средств пенсионных накоплений в НПФ являются легальными (ПФР, федеральный бюджет), а вероятность получения преступным путем средств, уплаченных в качестве страховых взносов работодателями и работниками, контролируется другими субъектами закона о противодействии легализации преступных доходов, напоминают разработчики.

Риск финансирования терроризма за счет пенсионных выплат по обязательному пенсионному страхованию, полученных из НПФ, по их мнению, «также отсутствует», поскольку: НПФ совершает закрытый перечень расходных операций за счет средств пенсионных накоплений; пенсионные выплаты из НПФ имеют целевое назначение; пенсионные выплаты осуществляются НПФ через других субъектов регулирования закона о противодействии легализации преступных доходов — кредитные организации и организации федеральной почтовой связи. НПФ не производит иных выплат, при этом условия и порядок выплат, производимых НПФ, идентичны условиям и порядку аналогичных выплат, производимых ПФР.

Как управлять пенсионными накоплениями?

«Адвокатская газета» запускает социально ориентированный проект. В рамках нового раздела «АГ-эксперт» адвокаты разъясняют сложные правовые вопросы для граждан, не имеющих юридического образования.

Кому доверить управление пенсионными накоплениями?

На сегодняшний день все граждане, у которых на счете имеются пенсионные накопления, имеют право самостоятельно выбрать страховщика, который будет управлять средствами накоплений. Под страховщиками законодатель понимает государственный и негосударственные пенсионные фонды. Непосредственное управление средствами осуществляет управляющая компания (УК). Самостоятельно выбрать управляющую компанию возможно, только если накопления застрахованного лица размещены в Пенсионном фонде РФ. Если же страховщиком является негосударственный пенсионный фонд, то последний самостоятельно определяет, кому доверить управление накоплениями.

Можно ли менять страховщика?

Менять страховщика можно не чаще одного раза в год, подав соответствующее заявление в территориальный орган ПФР лично или направив иным способом. Так, можно направить заявление в форме электронного документа, порядок оформления которого определяется Правительством РФ, путем использования информационно-телекоммуникационных сетей, доступ к которым не ограничен определенным кругом лиц, либо через многофункциональный центр предоставления государственных и муниципальных услуг.

Формы заявлений застрахованного лица о переходе и о досрочном переходе в фонд и инструкции по заполнению этих форм утверждаются Пенсионным фондом. Ознакомиться с порядком их заполнения можно на официальном сайте ПФР, в помещениях его территориальных органов, а также через Федеральную государственную информационную систему «Единый портал государственных и муниципальных услуг» или многофункциональные центры предоставления государственных и муниципальных услуг (МФЦ).

Помимо подачи заявления о переходе (или досрочном переходе), застрахованному лицу необходимо заключить договор с выбранным негосударственным пенсионным фондом. Такой договор обязательного пенсионного страхования вступает в силу с того дня, когда средства пенсионных накоплений будут зачислены на счет НПФ.

В чем разница между «срочными» и «досрочными» заявлениями о переходе в новый фонд?

Право на смену страховщика и перевод средств пенсионных накоплений, включая инвестиционный доход, гражданину предпочтительно реализовать один раз в пять лет. Такое заявление рассматривается фондом до 1 марта года, следующего за годом, в котором истекает пятилетний срок с года подачи заявления. Перевод средств выбранному страховщику осуществляется до 31 марта года рассмотрения заявления.

В свою очередь, заявление о досрочном переходе рассматривается до 1 марта года, следующего за годом подачи заявления, а перевод средств осуществляется до 31 марта того же года. Например, при подаче в 2018 г. заявления о досрочном переходе оно будет рассмотрено в 2019 г., тогда же будет осуществлен перевод денежных средств. Главный риск заключается в том, что в случае досрочного перехода новому страховщику будут переданы средства без инвестиционного дохода или гарантийного восполнения инвестиционного убытка (при их наличии) с даты последнего расчета гарантируемой суммы средств пенсионных накоплений.

Таким образом, отличия заявлений о переходе и о досрочном переходе заключаются в различных сроках их рассмотрения, сроках фактического перехода к новому страховщику и сроках перевода средств, а также в различном порядке расчета средств пенсионных накоплений, подлежащих передаче при таких переходах.

Что выбрать – управляющую компанию или негосударственный пенсионный фонд?

В случае если гражданин никогда не обращался в Пенсионный фонд с заявлением о смене страховщика или выборе управляющей компании, он автоматически формирует свои пенсионные накопления через ПФР. Инвестирует их в этом случае государственная УК Внешэкономбанк, с которой у ПФР заключен договор доверительного управления средствами пенсионных накоплений.

Разница между управляющими компаниями и негосударственными пенсионными фондами заключается в том, что если пенсионные накопления находятся в доверительном управлении первых, то учет средств пенсионных накоплений и результатов их инвестирования, назначение и выплату накопительной пенсии осуществляет Пенсионный фонд; во втором случае – выбранный гражданином негосударственный пенсионный фонд.

Примерными критериями выбора УК, в случае если накопления застрахованного лица размещены в ПФР, могут служить размер ее уставного капитала, продолжительность работы компании, показатель доходности управления, а также совокупный объем средств пенсионных накоплений граждан, находящихся в управлении. При выборе негосударственного пенсионного фонда, помимо предложенных критериев, следует обратить внимание на количество учредителей фонда и доступность предоставляемой им информации.

Информацию об основных показателях деятельности негосударственных пенсионных фондов можно получить на официальном сайте Центрального банка России, а ознакомиться с Реестром лицензий негосударственных пенсионных фондов – на сайте Пенсионного фонда. Также может оказаться полезен официальный сайт Федеральной налоговой службы России в части предоставления сведений, содержащихся в ЕГРЮЛ, об организации-страховщике.
Ответственность за пенсионные накопления граждан в зависимости от выбора страховщика несет Пенсионный фонд или негосударственный пенсионный фонд.

Для повышения совокупного объема средств пенсионных накоплений граждан НПФ предлагают, как правило, более выгодные условия, нежели Пенсионный фонд. Однако, выбрав негосударственный пенсионный фонд в качестве страховщика, застрахованное лицо должно осознавать риски, например то, что такой фонд – это прежде всего «частная компания», у которой при совершении нарушений может быть аннулирована лицензия, что приведет к невозможности осуществления дальнейшей деятельности.

Что делать, если у НПФ аннулировали лицензию?

Застрахованным лицам, чьи накопления находятся в негосударственном пенсионном фонде, в случае аннулирования лицензии специальных мер принимать не нужно для того, чтобы вернуть свои денежные средства.

Начиная с даты аннулирования лицензии у действующего страховщика – негосударственного пенсионного фонда новым страховщиком в системе обязательного пенсионного страхования станет Пенсионный фонд.

При этом сумма средств пенсионных накоплений, гарантированная к передаче в ПФР, составит сумму взносов, которые были уплачены работодателями застрахованного лица, без учета инвестиционного дохода, а также средства, уплаченные в рамках Программы софинансирования и сформированные за счет материнского (семейного) капитала.

Что делать, если накопления неправомерно были переведены в НПФ?

С образованием негосударственных пенсионных фондов появились мошеннические схемы, позволяющие без ведома застрахованного лица осуществлять перевод его пенсионных накоплений из одного фонда в другой. Так, например, заявление о переходе в НПФ может быть предоставлено заемщику при оформлении кредитного договора в банке вместе с внушительным пакетом документов, которые, как правило, заемщик не читает. Или, напротив, выдача кредита ставится в зависимость от перехода заемщика в негосударственный пенсионный фонд. Обычно человек, нуждающийся в заемных средствах, подписывает предоставленное ему заявление, зачастую даже не осознавая правовых последствий своих действий.

Получить информацию о размещении своих пенсионных накоплений можно в территориальном органе ПФР. Если после обращения в пенсионный орган выяснится, что накопления были переведены в НПФ, можно вернуть их обратно в Пенсионный фонд. Для этого необходимо не позднее 31 декабря текущего года подать заявление о переводе средств пенсионных накоплений в территориальный орган ПФР по месту жительства. При желании можно остаться в этом негосударственном пенсионном фонде или перейти в другой фонд.

Помимо этого, можно обратиться с письменной претензией в негосударственный пенсионный фонд, в который был осуществлен перевод пенсионных накоплений. В ответ на претензию фонд обязан предоставить информацию об основаниях перевода накоплений. Также гражданин вправе обратиться в правоохранительные органы с заявлением о проведении проверки.

Систему пенсионного страхования будут снова реформировать

Правительство хочет трансформировать «замороженные» накопления в особую стандартизированную схему. Она оказалась весьма непростой.

В России запланировали провести очередную трансформацию пенсионных накоплений. Как сообщает «Коммерсантъ», речь идет о «замороженных» пенсионных накоплениях. По сведениям издания, их хотят трансформировать в «добровольную стандартизированную схему» (НПО).

О чем идет речь? На прошлой неделе Минфин провел совещание, посвященное накопительной компоненте обязательного пенсионного страхования и добровольным пенсионным программам. Ведомство поддержало введение системы гарантирования прав участников добровольных программ пенсионного страхования. «Замороженные» с 2014 года пенсионные накопления чиновники Минфина согласились трансформировать в стандартизированную схему с едиными правилами.

За минувшие 7 лет было несколько идей по трансформации этих накоплений, но ни одна из них не была реализована. Для простого обывателя все предложенные ранее схемы были непонятными и слишком сложными. Сложной оказалась и новая схема по «спасению» «замороженных» накоплений, которую уже окрестили «планом Б».

«План Б» – это концепция трансформации «замороженного» с 2014 года накопительного компонента обязательного пенсионного страхования (ОПС) в добровольную стандартизированную схему негосударственного пенсионного обеспечения (НПО) с едиными правилами. Среди этих правил – неснижаемый остаток в виде первоначального взноса, переведенного из ОПС, а также стимулирование последующих пенсионных взносов путем налоговых вычетов и государственным софинансированием. Авторы идеи уверяют, что это позволит создать работающий механизм пенсионных накоплений.

При этом глава Минфина Антон Силуанов уверен, что нужно распространить начальный пенсионный взнос от государства на всех вступивших в новую систему, а софинансирование дифференцировать в зависимости от размера дохода получателя: чем больше доход, тем меньше денег от государства он получает на свою будущую пенсию.

К системе планируют подключить и негосударственные пенсионные фонды. Перевод средств из фонда в фонд, таким образом, будет идентичен клиентским отношениям с банком по депозиту: разрыв договора с одним НПФ и заключение нового с другим с переводом средств в безналичной форме. Это должно стать простым и удобным механизмом по переводу пенсионных накоплений граждан.

Вопрос о том, что делать с пенсионными накоплениями, которые находятся в пенсионном фонде, остается дискуссионным и будет решаться после консультаций с госкорпорацией ВЭБ.РФ. Также Минфин планирует доработать вопросы о налоговых вычетах (предлагалось 6 % от дохода), софинансировании (предлагалось только для молодежи) и начальном бонусе для тех, кто вступил в систему (предлагалось только для молодежи с «нулевыми счетами»).

Тем не менее финальное решение по будущему идеи о трансформации ОПС в НПО будет приниматься на уровне правительства «и выше».

Очевидно, что пока в новом «плане Б» вопросов больше, чем ответов, а для простых россиян эта схема еще очень сложна для восприятия и понимания. К тому же она еще не одобрена и является дискуссионной.

НПФ-банкроты будут направлять остатки пенсионных накоплений в спецфонд — законопроект | 26.01.21

Группа депутатов и сенаторов во главе с председателем комитета нижней палаты парламента по финансовому рынку Анатолием Аксаковым внесла в Госдуму законопроект, который обяжет ликвидируемые негосударственные пенсионные фонды (НПФ) направлять оставшуюся после расчета со всеми кредиторами сумму пенсионных накоплений в Фонд гарантирования пенсионных накоплений (ФГПН). Документ размещен в электронной базе данных Госдумы.

Сейчас законодательно не урегулирован механизм использования средств пенсионных накоплений, оставшихся после удовлетворения требований кредиторов. Эти средства продолжают аккумулироваться на счетах НПФ, открытых в Агентстве по страхованию вкладов (АСВ), которое является конкурсным управляющим фондов при банкротстве.

В связи с этим законопроект предусматривает направление профицита средств пенсионных накоплений после окончания расчетов с кредиторами, чьи требования подлежат удовлетворению за счет соответствующих средств, в формируемый АСВ Фонд гарантирования пенсионных накоплений.

«Таким образом, направление в ФГПН средств, составляющих пенсионные накопления ликвидируемых негосударственных пенсионных фондов, оставшихся после завершения расчетов по требованиям кредиторов, подлежащим удовлетворению за счет указанных средств, будет соответствовать их целевому использованию», — отмечается в пояснительной записке к законопроекту.

В настоящее время средства из Фонда гарантирования пенсионных накоплений направляются АСВ на выплату гарантийного возмещения застрахованным лицам в системе обязательного пенсионного страхования.

Предусматривается, что закон в случае принятия вступит в силу по истечении 10 дней со дня его официального опубликования и будет применяться в случаях, если производство по делу о банкротстве НПФ возбуждено как после, так и до дня вступления в силу этих поправок.

Информационное агентство России ТАСС

В ПФР разъяснили, как получить единовременную выплату средств пенсионных накоплений

Фото: Николай Федоров / архив «Солидарности»

Единовременную выплату средств пенсионных накоплений могут получить граждане в 60 и 55 лет, выходящие на пенсию при достижении общеустановленного пенсионного возраста, отметили ТАСС  в отделении Пенсионного фонда России (ПФР) по Нижегородской области.

Получить все средства пенсионных накоплений одномоментно одной суммой кроме граждан, рожденных в 1967 году и позднее и имеющих пенсионные накопления, могут мужчины 1953–1966 годов рождения и женщины 1957–1966 годов рождения, если они официально работали с 2002 по 2004 год, а их работодатель платил страховые взносы. Кроме того, за выплатой могут обратиться участники программы государственного софинансирования пенсионных накоплений.

Подать заявление на выплату в ПФР или НПФ можно в любой момент после достижения соответствующего возраста.

Ранее Министерство финансов РФ поддержало идею о трансформации накопительной части обязательного пенсионного страхования, которая была заморожена с 2014 года, в стандартизированную схему негосударственного пенсионного обеспечения (НПО) с едиными правилами.  

С момента введения моратория на формирование накопительной части пенсии в рамках ОПС предлагалось несколько концепций ее оживления или трансформации в НПО. Так в 2019 году обсуждалась инициатива гарантированного пенсионного плана (ГПП), которую реализовать так и не удалось.

Напомним, что президент РФ Владимир Путин подписал закон, «замораживающий» накопительную часть пенсии еще на год, до конца 2023 года. Накопительный компонент пенсии остается заморожен с 2014 года.

«Солидарность» ранее сообщила о профсоюзной инициативе по выведению накопительного компонента из системы государственного обязательного пенсионного страхования. Письмо с соответствующим предложением за подписью главы ФНПР Михаила Шмакова было направлено на имя премьер-министра РФ Михаила Мишустина.

Почему обязательный накопительный компонент оказался проблемным и неэффективным – можно узнать в карточках «Солидарности» «Почему вам не нужна накопительная пенсия». Профсоюзы неоднократно требовали окончательно разобраться с накопительной компонентой.

Дождались: Минфин анонсировал новую пенсионную реформу

«Дождались»: Минфин анонсировал новую пенсионную реформу. Фото: Мария Бородина, ИА PrimaMedia

Минфин поддержал идею перевести «замороженную» накопительную часть обязательного пенсионного страхования (ОПС) в стандартизированную добровольную схему негосударственного пенсионного обеспечения (НПО) с едиными правилами.

Министр финансов РФ Антон Силуанов провёл совещание, в ходе которого поддержал введение системы гарантированных прав для участников добровольных программ. Также чиновники одобрили отказ от учёта при определении налоговой базы для взимания НДФЛ с пенсий по договорам, которые заключены в пользу членов семьи. Но важнейшим пунктом обсуждения стало согласие Минфина трансформировать «замороженный» накопительный  компонент ОПС в схему НПО с общими правилами.

Попытки трансформировать «замороженный» накопительный компонент ОПС в стандартизированную схему НПО выдвигались и ранее. Например, в 2016 году ЦБ и Минфин разработали индивидуальный пенсионный капитал (НПК). Тогда речь шла о квазидобровольном (лжедобровольном) участии застрахованных лиц: все застрахованные лица должны были стать участниками системы ИПК и делать взносы от 0% до 6% своего зарплаты, но имели бы право на 5-летние каникулы.

В 2019 году была выдвинута новая идея. Идея гарантированного пенсионного плана (ГПП), которая основывалась на полной добровольности участвующих граждан.

Новая реформа частично заимствует от НПК и ГПП идею стандартизированной схемы НПО с неснижаемым остатком в виде первоначального взноса, который будет переведён из ОПС. С последующим стимулированием взносов через налоговые вычеты и софинансирование. Но есть и ряд важных отличий:

• права собственности на накопительную часть перейдут от государства гражданам;
• в системе не будет единого центрального администратора;
• перевод ОПС в НПО будет сразу полным;
• средства из одного НПФ в другой можно будет направить, как банковский депозит: достаточно разорвать договор с одним фондом и заключить соглашение с другим с переводом средств в безналичной форме;

Вопрос о том, что же делать с пенсионными накоплениями в ПФР, будут решать после консультаций с Внешэкономбанком (ВЭБ). Силуанов попросил доработать вопросы о налоговых вычетах, софинансировании и начальном бонусе для всех, кто уже вступил в систему. Министр считает, что нужно давать начальный взнос от государства всем, кто вступил в новую систему. Софинансирование должно зависеть от благосостояния получателя: чем больше доход гражданина, тем меньше он должен получать денег.

Выпуск Legislative Tracking | «Делойт», СНГ

Банк России утвердил базовый стандарт защиты прав и интересов клиентов акционерных инвестиционных фондов и управляющих компаний

Документ вводит требования к объему информации, предоставляемой потребителям, устанавливает правила взаимодействия с ними, а также определяет порядок тестирования неквалифицированных инвесторов перед покупкой паев ЗПИФ.

Стандарт требует раскрытия управляющей компанией (акционерным инвестиционным фондом) в офисах, на сайте, в личном кабинете клиента и мобильном приложении информации о членстве в саморегулируемой организации, о способах направления обращений и досудебного урегулирования споров.

По запросу клиента ему следует предоставить информацию о размере комиссий, а также возможных дополнительных расходах.

Информация должна предоставляться в доступной форме и не допускать неоднозначных толкований.

При оказании услуг в банковском офисе или через банковский сайт либо мобильное приложение управляющая компания (акционерный инвестиционный фонд) обязана предупредить клиента о том, что переданные в доверительное управление средства не являются вкладом и не застрахованы.

Тестирование неквалифицированных инвесторов проводится по аналогичной процедуре, что и при покупке паев ЗПИФ у брокера.

В случае признания инвестора квалифицированным управляющая компания должна будет предупредить его о том, что этот статус открывает возможность покупать паи, которые в силу повышенных рисков предназначены для квалифицированных инвесторов.

В дальнейшем не реже одного раза в год управляющая компания обязана сообщать квалифицированному инвестору о праве подать заявление об отказе от этого статуса.

Положения стандарта о тестировании и информировании граждан, признанных управляющей компанией квалифицированными инвесторами, применяются с 1 октября 2021 года, а остальные положения — с 1 апреля 2022 года.

Источник: «Официальный сайт Банка России»

NPF College Draft 2019: Inside The Numbers

Драфт National Pro Fastpitch состоится в понедельник вечером. А фанаты НПФ явно задаются вопросом, кого выберут их команды.

В прошлый понедельник «Софтбол Америка» представил имитацию проекта. Создание имитационного драфта требует, чтобы аналитик рассмотрел множество факторов, включая потребности каждой команды, а также субъективные и объективные качества каждого игрока. Другими словами, в имитационных драфтах обычно делается целостный взгляд на оценку игроков.

Я собираюсь ответить на гораздо более простой вопрос: когда мы думаем об игроках, которые могут быть выбраны в понедельник вечером, насколько хорошо эти игроки выступили в студенческом софтболе как в 2018 году, так и в этом сезоне (по состоянию на 7 апреля)?

Статистика игрока по колледжу должна рассказать нам кое-что о том, как он может выступать на профессиональном уровне. Но, конечно, — как скажет вам любой, кто пытался изучить связь между колледжем и профессиональной успеваемостью в любом виде спорта, — статистика не может сказать вам всего.Тем не менее, полезно смотреть только на цифры от лучших потенциальных клиентов.
Это упражнение начинается с создания списка «лучших потенциальных клиентов». Игроки, перечисленные в фиктивном драфте Softball America, — хорошее место для начала. Этот список будет дополнен пожилыми людьми, внесенными в список 50 лучших игроков в софтбол, выдвинутых USA Softball.

Рейтинг этих игроков будет основан на статистике, собранной NCAA. В частности, для нападающих мы будем учитывать это традиционное среднее значение (BA) и OPS (базовый процент + среднее отбрасывание).Кроме того, я буду использовать модель линейных весов, чтобы оценить, сколько прогонов создал каждый нападающий. Прогоны каждого нападающего, созданные для каждого вида пластины (RCPA), будут в первую очередь использоваться для ранжирования нападающих.

В приведенный ниже список нападающих входят 23 игрока. И, как видно, с начала сезона 2018 самой результативной нападающей стала Алисса ДиКарло из Университета Джорджии. В 102 играх ДиКарло провел 112,2 раунда и является единственным игроком, который опубликовал RCPA выше 0.300. Аманда Лоренц — лучший нападающий в фиктивном драфте «Софтбол Америка» — была лишь немного менее продуктивна по количеству выходов на тарелку. Но поскольку Лоренц сыграл на шесть игр больше, чем ДиКарло, Лоренц лидирует среди всех нападающих с 114,8 созданными забегами. Другими словами, и ДиКарло, и Лоренц были действительно хороши!

Алисса Дикарло (INF, Джорджия): 0,407 BA, 1,475 OPS, 0,304 RCPA
Аманда Лоренц (OF, Флорида): 0,415 BA, 1,311 OPS, 0,286 RCPA
Abbey Cheek (UT, Кентукки): 0,383 BA, 1,318 OPS, 0.276 RCPA
Джессика Хартвелл (INF, Texas Tech): 0,381 BA, 1,265 OPS, 0,270 RCPA
Lilli Piper (SS, Ohio St.): 0,389 BA, 1,219 OPS, 0,262 RCPA
Amanda Sanchez (INF, Missouri & LSU): 0,410 BA , 1,286 OPS, 0,261 RCPA
Kelsey Horton (INF, New Mexico St.): 0,372 BA, 1,271 OPS, 0,261 RCPA
Sydney Romero (INF, Оклахома): 0,418 BA, 1,206 OPS, 0,255 RCPA
Aubrey Leach (INF, Теннесси) ): 0,437 BA, 1,086 OPS, 0,233 RCPA
Morgan Turkoly (OF, Технологический институт Луизианы): 0,394 BA, 1,088 OPS, 0.233 RCPA
Андрия Бут (OF, Гарднер-Уэбб): 0,455 BA, 1,043 OPS, 0,231 RCPA
Либби Сагг (C, BYU): 0,373 BA, 1,109 OPS, 0,227 RCPA
Casey McCrackin (INF, Auburn): 0,345 BA, 1.061 OPS, 0.209 RCPA
Киана Шерлунд (OF, Иллинойс): 0.391 BA, 1.017 OPS, 0.205 RCPA
Morgan Howe (OF, Arizona St.): 0.372 BA, 1.089 OPS, 0.203 RCPA
Cali Harrod (INF, Florida St. ): 0,291 BA, 0,969 OPS, 0,199 RCPA
Nichole Fry (INF, Long Beach St.): 0,357 BA, 1,016 OPS, 0,193 RCPA
Madi Sue Montgomery (INF, Oklahoma St.): 0,337 BA, 1,037 OPS, 0,190 RCPA
Kylan Becker (OF, Ole Miss): 0,392 BA, 0,952 OPS, 0,187 RCPA
Kendall Veach (INF, Auburn): 0,276, BA, 1,012 OPS, 0,178 RCPA
Jenny Schaper ( C, Кентукки): 0,329 BA, 0,974 OPS, 0,169 RCPA
Кэти Рид (INF, Кентукки): 0,354 BA, 0,967 OPS, 0,161 RCPA
Morgan Podany (OF, Auburn): 0,251, 0,707 OPS, 0,106 RCPA

Что насчет кувшины? Наиболее распространенные статистические данные, используемые для оценки питчеров, — это количество выигранных и проигрышных матчей и классическая средняя заработанная серия (ERA).Ворос Маккракен, однако, еще в 2001 году заметил, что ERA — не лучший показатель эффективности подачи, поскольку он зависит от игроков защиты вокруг питчера. Лучшая мера должна быть сосредоточена на факторах, не зависящих от защиты, или на таких факторах, как аутинги, прогулки, хоумран и попадания. Следовательно, перечисленные питчеры ранжируются в соответствии с FIP ERA (мера производительности питчера, основанная на аутах, прогулках, хоум-ранах и точках попаданий, кратко детализированных в Forbes).

Если мы сосредоточимся на ERA и конкуренции (т.е. питчер в топ-конференции?), Келли Барнхилл из Флориды и Меган Кинг из штата Флорида — лучшие игроки в фиктивном драфте Софтбол Америка — лучшие питчеры. Однако FIP ERA говорит, что нельзя упускать из виду Тарана Алвело из Вашингтона и Макайлу Мартин из Оберна. И если вы смотрите мимо питчеров из ведущих конференций, Николь Ньюман из Дрейка заслуживает серьезного внимания.

Николь Ньюман (Дрейк): 36-11, 1.05 ERA, 1.04 FIP ERA
Таран Алвело (Вашингтон): 40-9, 1.56 ERA, 1,60 FIP ERA
Морган Ракель (Остин Пи): 37-12, 1,72 ERA, 1,67 FIP ERA
Меган Кинг (штат Флорида): 45-8, 1,17 ERA, 1,89 FIP ERA
Макайла Мартин (Оберн): 26 -9, 1,34 ERA, 2,09 FIP ERA
Келли Барнхилл (Флорида): 50-9, 1,22 ERA, 2,12 FIP ERA
Джули ДиМартино (Свобода): 42-14, 1,53 ERA, 2,26 FIP ERA
Тейлор МакКуиллин (Аризона): 40-17, 1,58 ERA, 2,37 FIP ERA
Саванна Хибнер (Хьюстон): 34-18, 1,34 ERA, 2,57 FIP ERA
Tara Trainer (Индиана): 36-24, 2.32 ERA, 2,77 FIP ERA
Меган Гуд (Джеймс Мэдисон): 11-5, 1,80 ERA, 3,19 FIP ERA
Выставка Саманты (Техас A&M): 24-10, 2,12 ERA, 3,34 FIP ERA

Чикагские бандиты — лидеры забрать в понедельник вечером. Так кого же взять? Если ориентироваться строго по цифрам, то среди питчеров следует обратить внимание на Алевело, Кинга, Мартина и Барнхилла. А ДиКарло и Лоренц — лучшие нападающие.

Очевидно, Бандиты могут взять только одного из этих игроков. Это означает, что USSSA Pride, у которого будут следующие два пика, с большой вероятностью получит двух отличных игроков.Безусловно, один из этих игроков может быть среди тех, о которых мы уже упоминали. Конечно, Сьерра Ромеро, которая уже играет главную роль в USSSA Pride, может иметь другое предложение. Сидней Ромеро из Оклахомы — сестра Сьерры — с начала сезона 2018 совершила 90,1 трассы. Из перечисленных нападающих только ДиКарло и Лоренц создали больше. Следовательно, возможно, воссоединение семьи находится в картах для Прайда.

Вне зависимости от того, объединит ли Прайд сестер Ромеро или нет, Прайд, скорее всего, соберет двух очень хороших игроков со вторым и третьим пиками.Та же история с Бандитами в 4 и Кливленд Кометс, которые выбирают 5-е и 6-е места. Статистика говорит о том, что в этом драфте много талантов. Будет интересно посмотреть, какие игроки смогут превратить свой успех в колледже в высшую результативность в величайшей профессиональной лиге софтбола в мире.

ВИДЕО: Эбби Рамирес о безграничных спортсменах, объединении софтбола и академических наук

Софтбол Америка поговорила с профессиональным игроком в софтбол Эбби Рамирес.

Dark Ops Night Airsoft FAQ

Какой минимальный возраст для страйкбола ходить в стычках?

Минимальный возраст для занятий Walk on Airsoft — 11 лет.

Сколько человек мне нужно, чтобы посетить мероприятие Dark Ops?

Для нашего мероприятия нет минимального размера группы — приходите самостоятельно или в составе группы / команды!
Приглашаются все желающие, НО количество мест на мероприятии будет ограничено, поэтому бронируйте заранее!

Что нам нужно надеть на мероприятие Dark Ops?

Повседневная, свободная, удобная одежда, в которой вы можете легко передвигаться. Игроки, которые ходят пешком, смогут носить собственное снаряжение / снаряжение и т. Д. Клиентам, арендованным, будет предоставлен боевой комбинезон «все-в-одном», который они смогут надеть, если они того пожелают, и наши » dark ops »выпускает оборудование для страйкбола.Лучшая обувь — это ботинки для активного отдыха, прогулочные ботинки или старые кроссовки.

Какие средства защиты глаз нам нужны?

Мы сообщаем всем игрокам, что для страйкбола в темноте рекомендуется использовать полную защиту лица. Клиентам, сдающим в аренду, предоставляются полностью защитные очки для лица / глаз pro. Лица младше 18 лет ДОЛЖНЫ носить полную защиту лица. Минимальные требования к страйкболистам — это сертифицированные страйкбольные защитные очки / очки для стрельбы. Мы настоятельно рекомендуем всем игрокам Walk On носить очки без сетки и щитки для лица / десен для лучшей защиты от опасностей.

Можно ли использовать прицелы / очки ночного видения?

Да — однако мы оставляем за собой право обеспечить справедливое и равное распределение игроков с таким оборудованием в обеих командах. Дополнительная информация будет предоставлена ​​до мероприятия. У нас будут области окружающего освещения в игровой зоне. Игрокам будет выдан цилюм / светящаяся палочка для ношения на себе по соображениям удостоверения личности / безопасности.

Можно взять с собой фонарик?

Да — факелы будут разрешены — белый / красный / зеленый свет и т. Д. — НО используйте их с умом и тактически!

Предлагаете ли вы членство в страйкболе?

Да! Ознакомьтесь с нашим НОВЫМ пакетом членства в NPF Airsoft, чтобы получить большие преимущества и скидки!

Можем ли мы привезти наших BB на мероприятие dark ops?

Да! BB Tracer Round будут обязательными для события Dark Ops.Арендованное оружие будет оснащено снарядами Tracer и ББ. Мы также продаем гранулы BB различного веса и количества в нашем магазине на территории, если вам нужно их купить на вечер.

Как мне записаться на игру dark ops night?

Забронируйте, используя кнопки ниже, или позвоните нам, чтобы забронировать номер по телефону 0121 323 1000. Полная оплата потребуется для обеспечения вашего бронирования, поскольку количество мест ограничено.

NPY / NPF-родственный нейропептид FLP-34 Сигналы серотонинергических нейронов для модуляции аверсивного обонятельного обучения у Caenorhabditis elegans

Abstract

Аверсивное обучение имеет фундаментальное значение для животных, поскольку оно увеличивает шансы на выживание.В дополнение к классическим нейротрансмиттерам появились нейропептиды, которые модулируют такое сложное поведение. Среди них нейропептид Y (NPY), как хорошо известно, способствует приобретению аверсивной памяти у млекопитающих. Здесь мы идентифицируем нейропептидную систему, родственную NPY / нейропептиду F (NPF), в Caenorhabditis elegans и показываем, что эта система FLP-34 / NPR-11 необходима для обучения негативным ассоциациям, процесс, который напоминает передачу сигналов NPY у млекопитающих. Ортолог FLP-34 Caenorhabditis elegans NPY / NPF демонстрирует консервативные структурные признаки нейропептидов NPY / NPF всего билатерального происхождения.Мы показываем, что он необходим для аверсивного обонятельного обучения после сочетания диацетила с отсутствием пищи, но не для аппетитного обонятельного обучения в ответ на бутанон. Чтобы опосредовать обучение диацетилу и, таким образом, интегрировать аверсивный пищевой контекст с запахом диацетила, FLP-34 высвобождается серотонинергическими нейронами и передает сигналы через его эволюционно законсервированный NPY / NPF GPCR, NPR-11, в нижележащих интернейронах AIA. Активация NPR-11 в центре интеграции AIA позволяет избежать ранее привлекательного стимула.Это исследование открывает перспективы для более глубокого понимания стрессовых состояний, в которых аверсивное обучение приводит к чрезмерному избеганию.

ЗНАЧИМОЕ ЗАЯВЛЕНИЕ Аверсивное обучение возникло на ранних этапах эволюции, чтобы способствовать избеганию опасных и стрессовых ситуаций. В дополнение к классическим нейротрансмиттерам нейропептиды появляются как модуляторы сложного поведения, включая обучение и память. Здесь мы идентифицировали эволюционный ортолог нейропептида Y / нейропептида F у нематоды Caenorhabditis elegans , и мы обнаружили, что он необходим для обонятельного аверсивного обучения.Кроме того, мы выяснили нейронную цепь, лежащую в основе этого поведения избегания, и обнаружили новое скоординированное действие нейропептида Y / нейропептида F Caenorhabditis elegans и серотонина, которое может помочь в нашем понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе стрессовых расстройств, при которых возникает чрезмерное избегание. в неадаптивном поведении.

Введение

Процессы обучения и памяти развивались на ранней стадии эволюции, чтобы способствовать выживанию животных в динамической среде.Фундаментальные сведения о молекулярных субстратах обучения и памяти впервые были описаны у моллюска Aplysia californica (Pinsker et al., 1970; Frost et al., 1985). Последующие исследования на моделях позвоночных и беспозвоночных показали сохранение этих молекулярных принципов во всех типах животных (Ardiel and Rankin, 2010; Kandel, 2012).

Caenorhabditis elegans оказался мощной моделью для анализа молекулярных механизмов, участвующих в зависимой от опыта пластичности (Hobert, 2003).Нервная система C. elegans компактна и демонстрирует широкий спектр зависимых от опыта форм поведения, таких как неассоциативное и ассоциативное обучение (Ardiel and Rankin, 2010; Sasakura and Mori, 2013). Большинство классических парадигм кондиционирования основаны на сочетании отвращающих или благоприятных состояний кормления с вкусовыми, тепловыми и пахнущими сигналами, чтобы сформировать врожденное влечение или отталкивание животных к этим стимулам, что приводит к зависимому от опыта ремоделированию нервных цепей (Stetak et al., 2009; Ардиэль и Рэнкин, 2010). В дополнение к классическим системам нейротрансмиттеров геном C. elegans кодирует большое количество белков-предшественников нейропептидов, которые, по прогнозам, будут генерировать более 300 биоактивных пептидов (Van Bael et al., 2018a). Эти эволюционно древние молекулы в основном действуют через GPCR, большинство из которых также сохраняется во всех типах животных (Jékely, 2013; Mirabeau, Joly, 2013; Elphick et al., 2018). Структурное разнообразие нейропептидергических систем лежит в основе широкого спектра физиологических и поведенческих функций, включая обучение и память (Beets et al., 2012; Тагерт и Нитабах, 2012; Пеймен и др., 2019).

Одной из высококонсервативных нейропептидергических систем, участвующих в обучении и памяти как у позвоночных, так и у беспозвоночных, является система нейропептид Y / нейропептид F (NPY / NPF) (Krashes et al., 2009; Gøtzsche and Woldbye, 2016). NPY позвоночных и NPF беспозвоночных, а также их рецепторы (NPYR / NPFR) были обнаружены почти во всех билатериальных типах, исследованных на сегодняшний день (Fadda et al., 2019). У млекопитающих NPY в изобилии экспрессируется в ЦНС, где он по-разному влияет на обучение и формирование памяти в зависимости от области мозга, типа памяти и активированных подтипов NPYR (Gøtzsche and Woldbye, 2016).NPYR представляют собой рецепторы, связанные с G _{i / 0} , которые в основном постсинаптически расположены на глутаматергических нейронах лимбической системы, где они оказывают противовозбудительное действие, уменьшая высвобождение глутамата (Vollmer et al., 2016). Помимо роли в обучении и формировании памяти, нарушение передачи сигналов NPY, как было показано, снижает уровни серотонина, что приводит к поведенческой негибкости и территориальному агрессивному поведению (Karl et al., 2004). У Drosophila ортолог NPY NPF регулирует аппетитное обучение в соответствии с состоянием питания (Krashes et al., 2009). Недостаток пищи вызывает высвобождение NPF, который способствует аппетивному обонятельному обучению, ингибируя дофаминергические нейроны, которые проецируются в грибовидное тело (Krashes et al., 2009), важный центр интеграции у мух.

В C. elegans несколько нейропептидных рецепторов (NPR) были предсказаны как предполагаемые ортологи NPY / NPF-подобных рецепторов на основании сходства последовательностей (Keating et al., 2003). Крупномасштабный филогенетический анализ нейропептидных систем у билатериальных животных показал, что NPR-11 является ближайшим к C.elegans ортолог семейства рецепторов NPY / NPF (Mirabeau, Joly, 2013). Было показано, что этот рецептор модулирует локальное поисковое поведение и хемотаксис (CTX) в ответ на привлекательный запах изоамилового спирта, воспринимаемый AWC-нейронами. NPR-11 действует в постсинаптических по отношению к AWC интернейронах AIA, и его активация снижает ответы AWC на ​​изоамиловый спирт, механизм обратной связи, который способствует адаптации к запаху (Chalasani et al., 2010). Учитывая, что передача сигналов NPF, как известно, регулирует обучение у млекопитающих (Gøtzsche and Woldbye, 2016) и память аппетита у Drosophila (Krashes et al., 2009), мы предположили, что ортолог NPYR / NPFR NPR-11 участвует в зависимом от пищи обучении и памяти у C. elegans . Здесь мы демонстрируем, что npr-11 не требуется для аппетивного обонятельного обучения, но регулирует аверсивное обучение в ответ на запах диацетил. Связанные с NPY / NPF нейропептиды, кодируемые flp-34 , передают сигнал от серотонинергических нейронов через NPR-11 в интернейронах AIA обонятельного контура, опосредуя аверсивное обучение.

Материалы и методы

Штаммы и уход

Все C.elegans культивировали при 20 ° C на чашках со средой для выращивания нематод (NGM), засеянными бактериями Escherichia coli OP50 . Все эксперименты проводились с использованием молодых взрослых гермафродитов. Подробная информация о генотипах, источнике и цифрах, в которых использовался каждый штамм, представлена ​​в таблице 1.

Таблица 1.

Штаммы, используемые в этой статье, и соответствующие цифры ^a

Аппетивное обонятельное обучение в ответ на бутанон

Анализ обучения бутанону проводили, как сообщалось ранее (Kauffman et al., 2011) в помещении с климат-контролем при температуре 20 ± 0,5 ° C и относительной влажности 35–55%. Вкратце, синхронизированных однодневных гермафродитов промывали буфером M9 (Brenner, 1974) из планшетов для культивирования со средой для выращивания и собирали в коническую пробирку на 15 мл. После трех промывок половину популяции немедленно тестировали на наивный CTX по отношению к бутанону, а остальную часть выдерживали в течение 1 часа в пробирке. Затем этих голодных червей переносили на планшеты для кондиционирования NGM диаметром 90 мм, засеянные 1 мл OP50 E.coli , и 2 мкл 10% бутанона (разбавленного в 100% этаноле) пипеткой наносили на крышку. Через 1 час часть кондиционированных червей проверяли на CTX по отношению к бутанону ( t0 ), тогда как остальную популяцию помещали на 90-миллиметровые планшеты для хранения NGM, засеянные 1 мл OP50, на 30, 60 или 120 минут. В конце каждого интервала определяли CTX по отношению к бутанону для конкретной группы отдыха ( t30 , t60 и t120 ). CTX был протестирован на 90-миллиметровых чашках NGM без семян, на которые пипеткой было внесено 100–200 червей в исходную точку.Червям был предоставлен выбор между двумя равноотстоящими пятнами, содержащими 1 мкл NaN ₃ + 10% бутанон и 1 мкл NaN ₃ + этанол соответственно. Через 1 час подсчитывали червей и рассчитывали индекс CTX (CI) следующим образом:

Анализ обучения диацетилу

Анализ обучения диацетилу основан на анализе, описанном Vukojevic et al. (2012) с некоторыми модификациями. Животных подвергали воздействию 0,1% разбавленного диацетила как во время анализа, так и во время анализа CTX, и время кондиционирования было увеличено до 3 часов.Анализ проводился в помещении с контролируемым микроклиматом при 20 ° C ± 0,5 и относительной влажности 35-55%. Популяцию сытых синхронизированных молодых взрослых червей промывали 3 раза буфером CTX (Vukojevic et al., 2012), и сразу же тестировали наивное влечение к диацетилу на чашках CTX (Vukojevic et al., 2012). Приблизительно 100 червей пипетировали в исходную точку 90-миллиметрового планшета CTX, и им давали выбор между пятном из 1 мкл 0,1% диацетила (Sigma Millipore, разведенный в 100% этаноле) и эквидистантным контрольным пятном из 1 мкл 100% раствора. этанол (EtOH).Оба пятна также содержали 1 мкл 1 м NaN ₃ . Через 1 час было проверено распределение червей на пластине CTX, как описано (Bargmann et al., 1993), и рассчитан доверительный интервал следующим образом:

Для аверсивного обонятельного кондиционирования червей подвергали воздействию в течение 3 часов 2 мкл 0,1% диацетила, вносимого пипеткой непосредственно в центр крышки планшета CTX без семян. Чтобы предотвратить изменение концентрации диацетила из-за испарения во время кондиционирования, крышки планшетов CTX заменяли каждые 30 мин новыми крышками и свежим 0.1% диацетил. ДИ кондиционированных червей рассчитывали, как описано выше.

Несвязанное кондиционирование было выполнено путем воздействия на червей в течение 3 часов только одной реплики, как сообщалось ранее (Vukojevic et al., 2012). Контрольный образец, содержащий только диацетил, кондиционировали на стандартных планшетах NGM, засеянных 250 мкл E.coli OP50 с 2 мкл 0,1% диацетила, нанесенными пипеткой на крышку. Контроль без пищи был кондиционирован на чашках CTX без семян без какого-либо запаха.

Чтобы проверить десенсибилизацию, была применена ударная обработка для прерывания краткосрочного обучения, состоящая из комбинации тепловых и механических возмущений (Bernhard and van der Kooy, 2000).Планшеты для кондиционирования сначала выдерживали при 4 ° C в течение 15 мин. Затем черви собирали, периодически встряхивали в течение 30 с и дважды центрифугировали при 500 × g (1 мин в первом испытании и 2 мин во втором испытании). Контрольных червей для этого эксперимента, показавших десенсибилизацию, кондиционировали в течение 90 мин на планшетах CTX с 2 мкл неразбавленного диацетила, нанесенными пипеткой на крышку.

Молекулярная биология и создание трансгенных червей

Клеточно-специфическая спасательная конструкция для flp-34 была клонирована с использованием сборки ДНК NEBuilder HiFi (NEB) в векторе pSM (любезно предоставлен C.Баргманн, Университет Рокфеллера). КДНК flp-34 амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали по сайту KpnI. Промоторы tph-1p , ops-1p , gcy-17p и gcy-27p амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК N2 WT и клонировали перед фрагментом кДНК flp-34 . Для управления экспрессией во всех трех серотонинергических нейронах (NSM, HSN и ADF) была выбрана длинная последовательность промотора tph-1 (3124 нуклеотида перед сайтом начала трансляции) (Sze et al., 2002). Последовательности праймеров, использованные для клонирования кДНК flp-34 , и промоторы представлены в таблице 2. Конструкции вводили в синцитиальные гонады молодых взрослых червей в следующих концентрациях: tph-1p :: flp-34 at. 5 нг / мкл с 50 нг / мкл маркера коинъекции unc-122p :: gfp и 48 нг / мкл лестницы ДНК 1 т.п.н. (Thermo Fisher Scientific) в качестве ДНК-носителя, ops-1p :: flp-34 при 25 нг / мкл с 50 нг / мкл маркера коинъекции lin-44p :: gfp и 25 нг / мкл лестницы ДНК 1 т.п.н., gcy-17p :: flp-34 при 25 нг / мкл с 20 нг / мкл маркера коинъекции myo-2p :: mCherry и 26 нг / мкл лестницы ДНК размером 1 т.п.н. и gcy-27p :: flp-34 при 40 нг / мкл с 50 нг / мкл лин- Маркер коинъекции 44p :: gfp и 10 нг / мкл ДНК-лестницы размером 1 т.п.н.

Таблица 2. Праймеры

, используемые для амплификации и клонирования tph-1p, ops-1p, gcy-17p, gcy-27p и flp-34 Конструкции кДНК в векторе pSM ^a

The flp -34 (lst1666) V KO штамм был получен с помощью C. elegans оптимизированной CRISPR / Cas9-опосредованной делецией экзонов 2 и 3 (612 п.н.) (см. Расширенные данные на рис. 6-1). Усиленный Cas9 (eCas9) был очищен собственными силами от бактерий BL21, трансфицированных вектором, экспрессирующим pGh596-Cas9 (любезно предоставлен G.Холлопетер, Корнельский университет). Были разработаны две последовательности направляющей РНК (gRNA) (https://eu.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE), а также шаблон репарации, который индуцировал сдвиг рамки и включал преждевременный стоп-кодон в начале экзон 2 (область сигнального пептида), чтобы предотвратить дальнейшую трансляцию обоих зрелых пептидов, кодируемых flp-34 . Чтобы упростить выбор успешно отредактированных червей, мы использовали метод Co-CRISPR, в котором ген dpy-10 также был отключен редактированием CRISPR (Arribere et al., 2014; Paix et al., 2015). Смесь, содержащая все необходимые компоненты, вводилась молодым взрослым гермафродитам C. elegans (таблица 3).

Таблица 3.

последовательностей гРНК, используемых для нацеливания flp-34 и dyp-10 , и соответствующих последовательностей репарационной матрицы ^a

Плазмида для гетерологичной экспрессии npr-11 в CHO клетки получали путем направленного клонирования амплифицированной с помощью ПЦР кДНК npr-11 в pcDNA3.Вектор ТА 1 / V5-His-TOPO (Invitrogen).

Трансгены на основе фосмиды npr-11 :: sl2 :: gfp и flp-34 :: sl2 :: gfp были созданы путем клонирования последовательности sl2 :: GFP на С-конце npr- 11 и flp-34 открывают рамку считывания в фосмиде npr-11 -WRM0616cB05 и flp-34- WRM0615cD01, как сообщалось ранее (Tursun et al., 2009). Фосмиды npr-11 и flp-34 микроинъектировали в синцитиальную гонаду молодых взрослых червей в дозе 30 нг / мкл.

Анализ локомоции

Двигательную активность 15-20 молодых взрослых червей регистрировали в условиях сытости (на чашках с засеянным OP50 250 мкл) или после 1 часа голодания (на чашках без NGM). Передвижение регистрировалось в течение 10 минут со скоростью 2 кадра в секунду с использованием собственной системы слежения с 10-мегапиксельной камерой (GigEPRO GP11004M NET), рассеянным светодиодным источником света 12 × 12 дюймов для освещения животных в транс (Rosco LitePad) и двумя потребительскими фильтры конфиденциальности (3 M PF17.0), расположенные перпендикулярно стеклянному столику, где аналитические планшеты были расположены для усиления контраста.Программное обеспечение StreamPix Multicamera 6 использовалось для записи и получения видеопотоков, которые последовательно преобразовывались в кадры. Пользовательский сценарий MATLAB R2016a (MathWorks) использовался для отслеживания отдельных червей в последовательных кадрах. Затем каждую дорожку оценивали визуально, чтобы исключить неподвижные фоновые артефакты. Средняя скорость червей в течение записанных 10 минут была получена как результат анализа и использовалась для сравнения двигательной активности различных штаммов червей. Пользовательский сценарий MATLAB доступен по запросу.

Анализ паттерна экспрессии

Трансгенных червей Hermaphrodite помещали на подушку из 2% агарозы и иммобилизовали 1 м NaN ₃ (Sigma Millipore) в буфере M9. Характер экспрессии трансгенных животных визуализировали с помощью конфокального микроскопа Olympus FluoView FV1000 (IX81), а проекции стопки z анализировали с помощью программного обеспечения Imaris 7.2 (Bitplane). Для трансгенов npr-11 :: sl2 :: gfp и flp-34 :: sl2 :: gfp на основе фосмид идентификация клеток была основана на следующем: положение и морфология, совместная локализация с DiI (1,1′- окрашивание диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианина перхлоратом (Invitrogen) (Tong and Bürglin, 2010) и скрещивание с маркерными штаммами ( tph-1p :: DsRed2 , nlp-44p :: mCherry и srsx-3 :: gfp; str-2 :: dsRed2 , любезно предоставлено C.Баргманн, Университет Рокфеллера).

Анализ активации рецептора

Анализ активации in vitro GPCR для NPR-11 был проведен с использованием люминесцентного анализа на основе экуорина, как сообщалось ранее (Beets et al., 2012; Van Sinay et al., 2017; Peymen et al. ., 2019). Вкратце, клетки СНО, стабильно экспрессирующие индикатор кальций-экворин и беспорядочный белок Gα ₁₆ (ES-000-A24, PerkinElmer), трансфицировали pcDNA3.1 / npr-11 или пустым вектором pcDNA3.1 в концентрации 40–50%. % слияния с использованием Lipofectamine LTX и Plus Reagent (Invitrogen).Через 24 ч при 37 ° C клетки перемещали до 28 ° C O / N. В день скрининга клетки собирали при плотности 5 × 10 ⁶ клеток / мл в среде DMEM / F12 без фенолового красного (Invitrogen) с добавлением 0,1% BSA и загружали коэлентеразином H (Invitrogen) для восстановления Ca ²⁺ -чувствительный фотобелковый экворин. Планшеты для соединения, содержащие библиотеку из более чем 350 синтетических пептидов в конечной концентрации 10 мкМ (для идентификации лигандов NPR-11) или серийные разведения пептидов FLP-34 или NLP-1 (для анализа доза-ответ), помещали в MicroBeta2 LumiJET (PerkinElmer) для скрининга.Затем трансфицированные клетки загружали при плотности 25000 клеток / лунку и измеряли люминесценцию в течение 30 с при 469 нм. После активации рецептора Gα ₁₆ направляет передачу сигналов GPCR по пути PLC _β , способствуя внутриклеточному высвобождению Ca ²⁺ и сигналу люминесценции. Для нормализации сигнала люминесценции на основе общего количества Ca ²⁺ в каждой лунке добавляли 0,2% Triton X-100 (Merck) для лизирования клеток и измеряли максимальный отклик люминесценции еще в течение 30 с.Способность пептидов FLP-34 активировать NPR-11 определяли с помощью анализа зависимости реакции от дозы (от 10 мкм до 100 фм). Нанесенные на график ответы Ca ²⁺ рассчитывали как процент от наивысшего ответа, вызванного пептидами (100% активация), после вычитания значений отрицательного контроля (клеточная среда BSA без пептида) и нормализации к общему ответу Ca ²⁺ . Для построения сигмоидальных кривых доза-ответ использовали нелинейный регрессионный анализ, а значения EC ₅₀ были рассчитаны как медиана 95% доверительного интервала.Сравнение между активацией NPR-11 FLP-34 и NLP-1 оценивали с использованием 10-кратных серийных разведений (от 10 мкм до 1 нм) пептидов, и соотношение нормализованных ответов Ca ²⁺ было представлено для каждого концентрация пептида.

Пептиды

Скрининг активации GPCR проводили с использованием собственной библиотеки C. elegans , состоящей из более чем 350 пептидов семейства RF-амидов (FLP) и нейропептидоподобных белков (NLP). Библиотека была составлена ​​на основе прогнозов in silico и пептидомических данных (Husson et al., 2005; Van Bael et al., 2018b) и был специально синтезирован Thermo Fisher Scientific и GL Biochem. Пептиды FLP-34 и NLP-1, использованные в экспериментах по зависимости реакции от дозы, очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке Symmetry-C18 (картридж для ВЭЖХ 4,6 × 250 мм с размером пор 5 мкм) и количественно определяли с помощью бицинхониновой кислоты. кислотный протеиновый анализ. Массу пептидов проверяли масс-спектрометрией MALDI-TOF (времяпролетный анализатор с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы) на приборе Reflex IV (Bruker Daltonic).

Выравнивание NPF / NPY и сравнение экзон-интронной структуры генов, кодирующих пептиды NPF / NPY

Выравнивание NPF / NPY выполняли с использованием ClustalX 2.1 Multiple Sequence Alignment с параметрами по умолчанию (Jeanmougin et al., 1998; Larkin et al. ., 2007). Источник двухсторонних репрезентативных зрелых пептидов NPF / NPY указан в таблице 4 вместе с сокращениями названий видов. Программное обеспечение BOXSHADE (www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) использовалось для выделения консервативных аминокислот: идентичные остатки с минимальной сохранностью 70% выделены черным цветом, аминокислотные группы с очень похожими свойствами и минимум с сохранением 70% выделены темно-серым цветом, а группы аминокислот с очень похожими свойствами и минимальной степенью консервативности 55% выделены светло-серым цветом.

Таблица 4.

Виды и ссылки последовательностей, используемых для выравнивания зрелых пептидов

Анализ экзон-интронной структуры генов, кодирующих NPF / NPY, был выполнен путем сравнения нуклеотидов, транскриптов и белков-предшественников, кодирующих репрезентативные пептиды NPF / NPY. через билатерии. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности были получены из баз данных NCBI, WormBase и Joint Genome Institute. Инвентарные номера последовательностей, использованных для анализа, вместе с сокращениями названий видов приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Виды, инвентарные номера геномов, мРНК и белки-предшественники, использованные для анализа экзон-интронной структуры

Планирование эксперимента и статистический анализ

Анализ данных и статистические сравнения были выполнены с использованием программного обеспечения Prism 8 (GraphPad), настройки статистическая значимость до р <0,05. Подробная информация о статистической значимости между экспериментальными группами и общем количестве повторов (обозначенных n для анализов обучения и анализов активации рецепторов) или червей (обозначенных w для анализов локомоции) для каждого эксперимента представлена ​​в подписях к рисункам.

Обучающие анализы выполняли, по крайней мере, в два независимых дня, включая каждый раз от двух до четырех повторов для каждого условия для анализов наклона диацетила и 5 повторов для бутанон-положительного анализа ассоциации. Для анализов обучения диацетилу, сравнивающих различные условия для одного генотипа, данные были проанализированы с использованием теста Крускала-Уоллиса и апостериорного теста Данна для множественного сравнения (непараметрические данные) или одностороннего дисперсионного анализа ANOVA и теста множественных сравнений Тьюки (для параметрических данных). ).Для тестов на обучение диацетилу и бутанону, сравнивающих различные условия для нескольких генотипов, данные были проанализированы с использованием двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA и множественных сравнительных тестов Сидака или Тьюки. Анализы локомоции выполняли в трех экземплярах в 2 независимых дня, а разницу в средней скорости анализировали с помощью непарного теста t . Анализы активации рецепторов для измерения доза-ответ проводили в трех экземплярах, по крайней мере, в 2 независимых дня. Сравнение кальциевых ответов пептидов FLP-34 и NLP-1 в клетках, экспрессирующих NPR-11, проводили в двух экземплярах в трех независимых экспериментах.Данные были проанализированы с использованием теста Краскела-Уоллиса и апостериорного теста Данна .

Результаты

Npr-11 не требуется для аппетивного обонятельного обучения в ответ на бутанон

В Drosophila melanogaster нокдаун гена npfr нарушает аппетивное обонятельное обучение (Krashes et al., 2009). В C. elegans , ортолог этого рецептора, кодируемый геном npr-11 (Mirabeau and Joly, 2013), опосредует адаптацию к привлекательному запаху изоамилового спирта, воспринимаемому обонятельными нейронами AWC (Chalasani et al., 2010). Основываясь на этих выводах, мы предположили, что NPR-11 участвует в опосредованном AWC аппетитивном обучении. Чтобы проверить это, мы количественно оценили эффективность мутантов npr-11 в установленном тесте аппетитного обучения, называемом положительной бутаноновой ассоциацией, в котором черви учатся связывать пищу с бутаноном, запахом, обнаруживаемым AWC (Kauffman et al., 2011) . Мы подвергли червей лишению пищи в течение 1 часа, кондиционировали их в течение того же времени бутаноном в присутствии пищи и количественно оценили поведение CTX по отношению к бутанону до и после кондиционирования, рассчитав ДИ (рис.1 А ). Нетренированный WT C. elegans умеренно привлекал бутанон (рис. 1 B ). Как и ожидалось, кондиционированные черви показали сильно увеличенный CI и, таким образом, увеличили притяжение к одоранту сразу после кондиционирования (время 0, t0). Это повышенное влечение к бутанону постепенно снижалось в течение 2 часов, когда животных содержали на пище в отсутствие бутанона (рис. 1 B ). Поскольку наивное влечение животных WT к бутанону было немного ниже по сравнению с ранее сообщенными значениями ДИ (Kauffman et al., 2011), мы подтвердили идентичность нейронов AWC в этом штамме WT, исследуя асимметричную экспрессию str-2 , кодирующего рецептор, который воспринимает запах бутанона (Troemel et al., 1999). Предыдущие исследования продемонстрировали асимметричную идентичность нейронов AWC ^ON и AWC ^OFF , происходящих из взаимоисключающей экспрессии рецепторов STR-2 и SRSX-3, соответственно (Troemel et al., 1999; Lesch et al., 2009). Этот взаимоисключающий паттерн экспрессии сохранялся у штамма WT, показывающего положительную ассоциацию бутанона (рис.1 C ), предполагая, что идентичность AWC не нарушена у этого штамма и незначительные отклонения в CI, скорее всего, являются результатом различий в экспериментальных условиях.

Рисунок 1.

мутанты npr-11 демонстрируют нормальное аппетивное обонятельное обучение в ответ на бутанон. A , Схема положительной парадигмы ассоциации бутанона (Kauffman et al., 2011). Синхронизированных по возрасту червей смывают с планшетов для культивирования и сразу же проверяют на наивный CTX на бутанон.Остальным животным подвергают 1 час лишения пищи, а затем 1 час кондиционирования с пищей и бутаноном. Часть популяции немедленно тестируется на CTX на бутанон (обучение CTX, t0), в то время как остальных животных держат на планшетах с засеянным пищей в течение 30, 60 или 120 минут перед тестированием CTX на бутанон (память CTX). B , мутанты npr-11 не являются дефектными по положительной ассоциации бутанона. Для каждой временной точки (t0 = 0, t30 = 30, t60 = 60 и t120 = 120 мин после кондиционирования) значения CI для мутантов npr-11 аналогичны таковым для WT.Данные были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ( F , _(4,90) = 102,5, p <0,0001) и теста множественного сравнения Сидака ( n = 10). Коробчатые диаграммы представляют 25-й (нижняя граница) и 75-й (верхняя граница) процентили. 50-й процентиль (линия) показывает медианное значение. Усы показывают минимальное и максимальное значения. Черные точки обозначают индивидуальные КЭ. C , животные WT демонстрируют асимметричную экспрессию генов, кодирующих рецептор str-2 и srsx-3 , в нейронах AWC ^ON и AWC ^OFF .Репрезентативные конфокальные проекции z -стека нейронов AWC у трансгенных взрослых гермафродитов, экспрессирующих srsx-3 :: gfp; str-2 :: dsRed2 трансген ( kyIs408 ) в репортерном штамме (CX7894, любезно предоставлен К. Баргманном, Университет Рокфеллера) до (слева) и после (справа) скрещивания со штаммом WT, используемым в положительных анализах ассоциации бутанона . A, передний; P, задний; D, спинной; V, вентрально. Масштабные линейки 10 мкм. нс, не имеет значения.

Как и животные WT, мутанты npr-11 показали повышенное влечение к бутанону после кондиционирования (t0), что позволяет предположить, что NPR-11 не опосредует этот тип аппетивного обонятельного обучения (рис.1 В ). Кроме того, CI прогрессивно снижался как у WT, так и у мутантных животных npr-11 с течением времени (t30, t60, до t120 после кондиционирования), что указывает на нормальное угасание памяти аппетита после тренировки (рис. 1 B ). В совокупности наши результаты показывают, что для обучения и сохранения положительной связи между бутаноном и пищей не требуется npr-11 .

Мутанты Npr-11 дефектны в аверсивном обонятельном обучении

Поскольку передача сигналов NPR-11 не требуется для аппетивного обонятельного обучения в ответ на бутанон, мы спросили, участвует ли он в обучении негативным ассоциациям, процессу, который напоминает Передача сигналов NPY у млекопитающих (Gøtzsche and Woldbye, 2016).Чтобы исследовать, являются ли мутанты npr-11 дефектными в отношении аверсивного обонятельного обучения, мы изменили установленный протокол кондиционирования (Stetak et al., 2009; Vukojevic et al., 2012), сочетая краткосрочное лишение пищи с воздействием разбавленного диацетила, который мы называем обучение диацетилом (рис. 2 A ). После сочетания диацетила с отсутствием пищи поведенческие предпочтения червей по отношению к пахучему диацетилу меняются с привлекательного на отталкивающее.

Рисунок 2.

npr-11 мутанты дефектны в обучении диацетилу. A , Схема анализа обучения диацетилу, модифицировано из Vukojevic et al., (2012). Синхронизированных по возрасту червей отмывают от планшетов для культивирования и сразу же тестируют на наивный CTX на диацетил, в то время как оставшиеся животные подвергаются 3-часовому комбинированному (диацетил + отсутствие пищи) или несвязанному (только диацетил или без пищи) кондиционированию. Преобразование СТХ в диацетил затем количественно определяют на планшетах СТХ; и через 1 час рассчитывается CI. B , червяки WT после сопряженного кондиционирования (конд.) показывают значительное снижение ДИ по сравнению с животными, обработанными только диацетилом (слева) или без пищи (справа). Данные были проанализированы с помощью Крускала-Уоллиса (KW (2) = 24,15, p <0,0001) и тестов множественного сравнения Данна (слева, n ≥ 10) или однофакторного дисперсионного анализа ANOVA ( F _(2,13) = 17,37, p = 0,0002) и апостериорный тест Тьюки (справа, n ≥ 5). C , nmr-1 мутанты демонстрируют нарушение обучения диацетилу по сравнению с WT.Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительный эффект генотипов ( F _(1,30) = 13,83, p = 0,0008) поведенческих методов лечения ( F _(1,30) = 83,83, p <0,0001), а также взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(1,30) = 13,14, p = 0,0011). Данные были проанализированы с помощью теста множественного сравнения Сидака ( n ≥ 7). D , Шоковая терапия обращает вспять сниженное влечение к диацетилу у животных, подготовленных к обучению диацетилу (усл.), но не в контрольной группе десенсибилизации, подвергшейся воздействию неразбавленного диацетила. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ( F , _(7,33) = 11,50, p <0,0001) и апостериорного теста Тьюки ( n ≥ 4). E , npr-11 мутанты демонстрируют нормальное влечение к диацетилу до кондиционирования, но имеют дефекты в обучении диацетилу. Двусторонний дисперсионный анализ показал значимое влияние генотипов ( F _(1,46) = 7.666, p = 0,0081), поведенческих методов лечения ( F _(1,46) = 94,92, p <0,0001) и взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _{(1,46 )} = 14,61, р = 0,0004). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Sidak ( n ≥ 10). F , G , npr-11 мутанты демонстрируют нормальную скорость передвижения во время еды и после еды. Активность регистрируется в течение 10 минут на E.coli OP50 засеянные ( F ) или незасеянные ( G ) чашки NGM. Средняя скорость мутантов существенно не отличается от скорости WT в обоих условиях. Данные анализировали с помощью непарного теста t ( F , w ≥ 23; G , w ≥ 39). B – G , Коробчатые диаграммы представляют 25-й (нижняя граница) и 75-й (верхняя граница) процентили. 50-й процентиль (линия) указывает медианное значение.Усы представляют собой минимальное и максимальное значения. Черные точки обозначают индивидуальные КИ или червей. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. нс, не имеет значения.

В нашем модифицированном протоколе мы кондиционировали животных 0,1% разбавленным диацетилом в течение 3 часов в отсутствие пищи. Сначала мы проверили, вызывает ли это обучение аверсивное ассоциативное обучение. Перед кондиционированием черви WT были сильно привлечены диацетилом и показали очень положительный ДИ (рис.2 В ). Как и ожидалось для аверсивного обучения, после сочетания отсутствия пищи с воздействием диацетила влечение к пахучим веществам уменьшалось, что приводило к значительному снижению ДИ (рис. 2 B ). Чтобы проверить, является ли эффект диацетилового влечения у кондиционированных животных результатом парной ассоциации диацетила и отсутствия пищи, а не воздействия одного из раздражителей, мы протестировали два непарных контроля, в которых животные подвергались воздействию только диацетила в наличие пищи или только лишение пищи без диацетила.Черви WT, кондиционированные как диацетилом, так и отсутствием пищи, меньше привлекались диацетилом. Однако их доверительный интервал для диацетила не был значительно снижен после тренировки с использованием только диацетила или без приема пищи (рис. 2 B ). Таким образом, совместное воздействие диацетила и голодания необходимо для снижения диацетилового влечения и действительно вызывает отвращение к ассоциативному обучению. Чтобы установить, представляет ли обучение диацетилу ассоциативное обучение, мы проверили эффективность мутантов nmr-1 , которые имеют мутацию в субъединице 1 рецептора NMDA.Потеря функции nmr-1 вызывает дефекты в ассоциативном обучении, но не в неассоциативном привыкании (Lau et al., 2013). Как и ожидалось для ассоциативного обучения, мутанты рецептора NMDA были дефектными в обучении диацетилу, так как они все еще сильно притягивались к одоранту после кондиционирования (фиг. 2 C ). Мы также проверили, вызвано ли снижение влечения к диацетилу после кондиционирования обучением, а не десенсибилизацией, формой адаптации (Colbert and Bargmann, 1997; Nuttley et al., 2001). Адаптация отличается от обучения, поскольку она характеризуется временной неспособностью ощущать диацетил и реагировать на него из-за насыщения рецепторов и интернализации. Чтобы проверить это, мы подвергли животных после кондиционирования механическому и тепловому шоку, который стирает кратковременную память, но не снижает чувствительность (Nuttley et al., 2001). В качестве контроля десенсибилизации мы включили экспериментальную группу, подвергшуюся воздействию неразбавленного диацетила в течение 90 минут (Colbert and Bargmann, 1997). Животных кондиционировали с помощью 0.1% диацетил показал значительное увеличение ДИ после шоковой обработки, как и ожидалось для обучения (фиг. 2 D ). Такое же лечение не повлияло на CI контрольной группы, подвергшейся воздействию неразбавленного диацетила, характерного для десенсибилизации (рис. 2 D ). В совокупности эти результаты показывают, что 3-часовое воздействие 0,1% диацетила в отсутствие пищи вызывает аверсивное ассоциативное обучение.

Затем мы оценили обучение диацетилу мутантов с потерей функции npr-11 .В отличие от животных WT, мутанты npr-11 все еще сильно притягивались к диацетилу после кондиционирования (фиг. 2 E ). Поскольку этот диацетиловый дефект обучения может быть вызван общим дефектом в нервных цепях, участвующих в локомоции, мы количественно оценили скорость мутантов npr-11 в условиях сытости и после 1 часа голодания, чтобы проверить потенциальные дефекты опорно-двигательного аппарата. Животные-мутанты двигались со средней скоростью, аналогичной скорости червей дикого типа, как при кормлении, так и при голодании (рис.2 F , G ). Необученные мутанты npr-11 также показали нормальное влечение к диацетилу (фиг. 2 E ). Вместе эти результаты предполагают, что передача сигналов npr-11 не влияет на общую локомоцию или восприятие диацетила, но необходима для обучения диацетилу.

NPR-11 необходим в интернейронах AIA для обучения диацетилу

Чтобы пролить свет на клетки, в которых NPR-11 необходим для обучения диацетилу, мы исследовали паттерн экспрессии рецептора.Черви, экспрессирующие трансген GFP, рекомбинированный с фосмидой, для npr-11 , проявляли флуоресценцию в нескольких нейронах головы и хвоста (фиг. 3 A ). Этот трансген подтвердил ранее описанную экспрессию npr-11 в интернейронах AIA (Chalasani et al., 2010) (Fig. 3 A ). Кроме того, мы наблюдали экспрессию npr-11 в сенсорных нейронах ASK и ADL, подтвержденную окрашиванием DiI нейронов амфид, а также в нескольких неидентифицированных клетках в голове (рис.3 А ). В хвосте репортерный трансген npr-11 экспрессировался в PVQ и, скорее всего, в нейронах DVA или DVC (фиг. 3 A ).

Рисунок 3.

Обучение диацетилу требует передачи сигналов NPR-11 в интернейронах AIA. A , Типичные конфокальные проекции z -стека нейронов головы и хвоста, экспрессирующие основанный на фосмиде репортерный трансген npr-11 :: sl2 :: gfp у взрослых гермафродитов. Вверху, экспрессия npr-11 в интернейронах AIA.В центре показана экспрессия npr-11 в сенсорных нейронах ASK и ADL, совместно локализованная с окрашиванием DiI этих сенсорных нейронов амфиды. Внизу: экспрессия npr-11 в нейронах хвоста, включая PVQ и, скорее всего, DVA или DVC. A, передний; P, задний; D, спинной; V, вентрально. Масштабные линейки 10 мкм. B , npr-11 требуется в AIA для обучения диацетилу. Экспрессия WT-копий npr-11 с AIA-специфичного промотора gcy-28d устраняет дефект обучения диацетилу у мутантов npr-11 .Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительный эффект генотипов ( F _(2,38) = 8,668, p = 0,0008) поведенческого лечения ( F _(1,38) = 95,49, p <0,0001), а также взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(2,38) = 6,154, p = 0,0048). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Сидака и Тьюки ( n = 7). C , мутанты nlp-1 не являются дефектными в обучении диацетилу.CTX мутантов nlp-1 по диацетилу до и после кондиционирования напоминает CTX червей WT. Двусторонний дисперсионный анализ показал только значительный эффект поведенческих методов лечения ( F _(1,28) = 60,95, p <0,0001). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Sidak ( n = 8). B , C , прямоугольные диаграммы представляют 25-й (нижняя граница) и 75-й (верхняя граница) процентили. 50-й процентиль (линия) указывает медианное значение.Усы представляют собой минимальное и максимальное значения. Черные точки обозначают индивидуальные КЭ. * p <0,05, *** p <0,001, **** p <0,0001. нс, не имеет значения.

Интернейроны AIA играют хорошо описанную роль центров сенсорной интеграции, участвующих в аверсивном обучении (Chalasani et al., 2010; Dobosiewicz et al., 2019). Поэтому мы спросили, требуется ли npr-11 в этих нейронах для обучения диацетилу. Восстановление экспрессии npr-11 в AIA под контролем gcy-28.d , было достаточно для восстановления диацетильного обучения мутантов npr-11 до уровня WT-червей, что указывает на то, что NPR-11 действует в AIA, опосредуя этот тип обучения (фиг. 3 B ).

Мутанты Nlp-1 демонстрируют нормальное обучение диацетилу

Сообщалось, что один из нейропептидов NLP-1, связанных с буккалином (MDANAFRMSFa), активирует NPR-11 и тем самым подавляет поведение локального поиска (Chalasani et al., 2010). Поскольку npr-11 также необходим для обучения диацетилу, мы проверили, опосредуется ли этот эффект NLP-1.Если нейропептиды NLP-1 модулируют обучение диацетилу путем активации NPR-11, мы ожидаем, что мутанты nlp-1 будут повторять дефект обучения, наблюдаемый для npr-11 в анализе диацетила. Однако после 3 ч кондиционирования диацетилом в отсутствие пищи мутанты nlp-1 показали пониженное влечение к диацетилу, подобное поведению животных WT (фиг. 3 C ). Эти результаты предполагают, что NLP-1 не требуется для обучения диацетилу, а NPR-11 может активироваться другими лигандами в цепи аверсивного обонятельного обучения.

C. elegans Ортолог NPY / NPF FLP-34 дозозависимо активирует NPR-11 in vitro

Для поиска нейропептидных лигандов NPR-11, участвующих в обучении диацетила, мы использовали подход обратной фармакологии и протестировали функциональный ответ этого GPCR на синтетическую библиотеку пептидов C. elegans в репортерном анализе на основе кальция (фиг. 4 A ). В этом клеточном анализе клетки яичника китайского хомячка (СНО), экспрессирующие NPR-11, заражали библиотекой из более чем 350 пептидов FLP и NLP.Два пептида, происходящие от гена-предшественника нейропептида flp-34 , дозозависимо активировали NPR-11 со значениями EC ₅₀ в наномолярном диапазоне (рис. контрольный вектор не показал ответов кальция (фиг. 4 C ). Пептиды NLP-1 не активировали NPR-11 при экспрессии в клетках CHO, используя наши показания активации рецептора на основе кальция (рис. 4 C ).

Рисунок 4.

нейропептидов FLP-34 семейства нейропептидов NPY / NPF активируют NPR-11 in vitro . A , Схема анализа активации рецепторов на основе кальция для идентификации лигандов NPR-11. Рецептор экспрессируется в клетках СНО, которые стабильно коэкспрессируют беспорядочную субъединицу Gα ₁₆ и люминесцентный индикатор кальция экуорин. После активации рецептора передача сигнала NPR-11 через Gα ₁₆ активирует фосфолипазу C _β (PLC _β ), что приводит к внутриклеточной мобилизации Ca ²⁺ , контролируемой люминесцентным биосенсором экворином. B , Два пептида предшественника FLP-34 дозозависимо активируют NPR-11 с наномолярным EC ₅₀ . Ответы Ca ²⁺ клеток СНО, экспрессирующих NPR-11, показаны как процент от наивысшего ответа, вызванного пептидами (100% активация). Планки погрешностей указывают на SEM ( n ≥ 7). C , пептиды FLP-34, но не NLP-1, дозозависимо активируют NPR-11. Гистограммы представляют собой соотношение общего кальциевого ответа клеток CHO, экспрессирующих NPR-11 (вверху) или pcDNA3.1 пустой вектор (внизу), зараженный пятью 10-кратными серийными разведениями пептидов (от 10 ⁴ до 1 нМ), БСА (отрицательный контроль) или АТФ (положительный контроль). Пептидные последовательности следующие: FLP-34-1 (ADISTFASAINNAGRLRYa), FLP-34-2 (ALNRDSLVASLNNAERLRFa), NLP-1-1 (MDANAFRMSFa), NLP-1-2 (MDPNAFRMSFa), NLP-1-3 (VNLDPaNS) , НЛП-1-4 (СТВГЫНЛДАРНЫФВГЛ). Отношение общего кальциевого ответа рассчитывают как вызванный пептидами ответ, нормализованный к общему кальциевому ответу. Данные анализировали с помощью теста Краскела – Уоллиса, pcDNA3.1 :: npr-11 (KW (31) = 176,4, p <0,0001) и пустой вектор pcDNA3.1 (KW (31) = 78,69, p <0,0001) и Dunn's post hoc тестовое задание. Планки погрешностей указывают на SEM ( n = 8). D , Структура предшественника нейропептида FLP-34. Зеленым цветом обозначены области предшественника, кодирующие зрелые пептиды. Показаны пептидные последовательности (до амидирования). Вверху, Сайты расщепления для конвертаз протеинов. * р <0.05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Посттрансляционный процессинг предшественника нейропептида FLP-34 дает два зрелых пептида, FLP-34-1 и FLP-34-2 (фиг. 4 D ), присутствие обоих из которых подтверждено in vivo. методом масс-спектрометрии (Husson et al., 2014). Интересно, что нейропептиды FLP-34-1 и FLP-34-2 проявляют карбоксиконцевой мотив RXRF / Yamide, типичный для всех двухсторонних нейропептидов NPY / NPF (Fadda et al., 2019) (рис.5 А ). Кроме того, ген-предшественник flp-34 содержит консервативное соединение экзон-интрон после второго нуклеотида второго кодона аргинина (R) в С-концевом мотиве RXRF / Ya пептида FLP-34-2, который является консервативны в генах npy / npf нескольких протостомов и дейтеростомов в одном и том же положении (рис. 5 B ). Консервация этого соединения экзон-интрон вместе с консервативным мотивом последовательности NPY / NPF и лигандным взаимодействием FLP-34 с гомологом NPYR / NPFR NPR-11 предполагает, что flp-34 является ортологом npy и npf гены-предшественники обнаружены у других животных.

Рисунок 5.

FLP-34 является ортологом билатерианских пептидов NPF / NPY. A , Выравнивание аминокислотных последовательностей репрезентативных NPF / NPY из разных типов. Черный цвет представляет собой идентичные остатки с минимальной сохранностью 70%. Темно-серый цвет представляет собой аминокислотные группы с очень похожими свойствами и сохранностью минимум 70%. Светло-серый цвет представляет собой аминокислотные группы с очень похожими свойствами и сохранением как минимум 55%. FLP-34-1 и FLP-34-2 отображают типичный карбоксиконцевой мотив RXRF / Yamide для всех двухсторонних нейропептидов NPY / NPF.FLP-34-2 имеет консервативный остаток лейцина в положении 13 (считая от последней C-концевой аминокислоты в этом выравнивании), тогда как FLP-34-1 имеет остаток изолейцина в этом положении. Аббревиатуры видов и ссылки перечислены в таблице 4. B , Ген flp-34 демонстрирует консервативное соединение экзон-интрон, типичное для предшественников npy / npf . Слева: схема структур гена npf / npy . Экзоны представлены в виде прямоугольников (шкала указана на рисунке), тогда как интроны (i) показаны линиями (не в масштабе, длина интрона указана внизу).Экзоны, кодирующие белок-предшественник, имеют цветовую кодировку для обозначения сигнального пептида (черный), нейропептида (зеленый, с указанием названия), двухосновного или одноосновного сайта расщепления пропротеинконвертаз (пурпурный) и остальных областей-предшественников (серый ). Справа: подробное положение соединения экзон-интрон в кодирующих последовательностях npf / npy . Гены Bilaterian npf / npy обнаруживают консервативное соединение экзон-интрон, расположенное между вторым и третьим нуклеотидом второго аргининового кодона (рамка, обозначенная -1) С-концевого мотива RXRF / YG.У нематод только последовательность, кодирующая FLP-34-2, прерывается интроном, тогда как у Drosophila соединение экзон-интрон не консервативно в кодирующей области npf . Представление соединений экзон-интрон (как -1) было основано на Yanez-Guerra et al., 2019. Аббревиатуры видов и инвентарные номера последовательностей перечислены в таблице 5.

Мутанты с потерей функции

flp-34 фенокопирует дефект обучения диацетилу у мутантов npr-11

Поскольку нейропептиды FLP-34 активируют NPR-11 in vitro , мы спросили, участвуют ли они, как NPR-11, в обучении диацетилу.Таким образом, мутанты flp -34 должны демонстрировать тот же дефект обучения, что и мутанты npr-11 . Поскольку нуль-мутанты для flp-34 не были доступны, мы использовали редактирование генома CRISPR / Cas9 для создания мутанта с потерей функции flp-34 . Для этого мы сконструировали две гРНК для удаления экзона 2 и основной части экзона 3. Кроме того, репарационная матрица перекодировала преждевременный стоп-кодон в области сигнального пептида, чтобы предотвратить дальнейшую трансляцию оставшейся последовательности, включая оба пептида FLP-34. (Инжир.6 A , Расширенные данные Рис. 6-1). Подобно мутантам npr-11 , мутанты, дефектные в flp-34 , все еще демонстрировали сильное влечение к диацетилу после обучения (фиг.6 B ), тогда как на локомоционное поведение это не влияло (фиг.6 C , D ) . Более того, двойной мутант npr-11 и flp-34 обнаруживал дефект обучения, аналогичный дефекту обучения одиночных мутантов npr-11 и flp-34 (фиг. 6 B ). Отсутствие аддитивного эффекта у двойного мутанта указывает на то, что flp-34 и npr-11 действуют по одному и тому же генетическому пути.Вместе эти результаты предполагают, что нейропептиды FLP-34 передают сигнал через NPR-11 in vivo , чтобы опосредовать обучение диацетилу.

Рисунок 6.

мутанты flp-34 фенокопируют дефект мутантов npr-11 в обучении диацетилу. A , CRISPR / Cas9-индуцированная делеция в мутанте с потерей функции flp-34 . Прямоугольники представляют экзоны, кодирующие FLP-34, пронумерованные 1-5. Линии между прямоугольниками обозначают интроны. Часть интрона между экзонами 1 и 2 обрезана.Красный представляет делецию CRISPR / Cas9 ( lst1666 ). Стоп-кодон, введенный в экзон 2, прерывает трансляцию области сигнального пептида, предотвращая синтез последующих последовательностей, содержащих оба зрелых пептида. Горизонтальные линии обозначают последовательности сигнального пептида (черный) и зрелого пептида (зеленый). Дополнительную информацию об удалении, отредактированном CRISPR / Cas9, можно найти на рис. 6-1 расширенных данных. B , flp-34 мутанты дефектны в обучении диацетилу.CI мутантов flp-34 после кондиционирования аналогичен CI кондиционированных мутантных животных npr-11 и значительно отличается от WT. Ан нпр-11 ; flp-34 двойной мутант не обнаруживает аддитивных дефектов обучения. Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительный эффект генотипов ( F _(3,52) = 3,262, p = 0,0286) поведенческого лечения ( F _(1,52) = 116,1, p <0,0001), а также взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(3,52) = 4.048, p = 0,0116). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Sidak ( n ≥ 7). C , D , flp-34 мутанты демонстрируют нормальную скорость передвижения при включении и выключении пищи. Активность регистрировали в течение 10 минут на чашках NGM с засеянным OP50 ( C ) или незасеянным ( D ) планшетами. Средняя скорость мутантов существенно не отличается от скорости WT в обоих условиях. Данные анализировали с помощью непарного теста t ( C , w ≥ 75; D , w ≥ 11). B – D , Коробчатые диаграммы представляют 25-й (нижняя граница) и 75-й (верхняя граница) процентили. 50-й процентиль (линия) указывает медианное значение. Усы представляют собой минимальное и максимальное значения. Черные точки обозначают индивидуальные КИ или червей. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. нс, не имеет значения.

Рисунок 6-1. Делеция, отредактированная CRISPR / Cas9

, в гене flp-34 . Локальное выравнивание гена flp-34 WT с мутантным аллелем flp-34 (lst1666) .Экзоны, фланкирующие делецию, показаны серым цветом. Перекодированные области в аллеле lst1666 выделены желтым цветом, а стоп-кодон — красным. Две гРНК, использованные для создания делеции, показаны синим цветом. Скачать Рис. 6-1, файл EPS.

Экспрессия Flp-34 в серотонинергических нейронах необходима для обучения диацетилу

Затем мы спросили, какие клетки экспрессируют flp-34 , чтобы лучше понять модулирование нейронной цепи NPY / NPF. диацетил обучения.Мы создали репортерный трансген на основе фосмид для flp-34 и обнаружили стойкую флуоресценцию в нескольких нейронах головы и хвоста, а также в области вульвы (рис. 7 A ). Репортерный трансген flp-34 экспрессировался во всех серотонинергических нейронах (NSM, HSN и ADF) (Horvitz et al., 1982), что подтверждено совместной локализацией сигнала GFP с экспрессией красного репортерного трансгена для триптофангидроксилазы 1. ( tph-1p :: DsRed2 ), который кодирует фермент биосинтеза серотонина (Sze et al., 2002) (рис.7 А ). Трансген flp-34 также экспрессировался в сенсорных нейронах ASG, что подтверждено совместной локализацией со специфическим репортером ASG ( nlp-44p :: mCherry ), в сенсорных нейронах хвоста PHA, что подтверждено окрашиванием DiI, и в PLN и ALN нейроны, идентифицированные по их морфологии и положению (рис. 7 A ).

Рисунок 7.

flp-34 требуется в серотонинергических нейронах для обучения диацетилу. A , Типичные конфокальные проекции z -стека нейронов головы, тела и хвоста, экспрессирующие фосмидный трансген flp-34 :: sl2 :: gfp у взрослых гермафродитов.Экспрессия flp-34 в серотонинергических нейронах NSM, ADF (головная панель) и HSN (основная панель) была идентифицирована путем совместной локализации с маркерным трансгеном tph-1p :: DsRed2 . Стрелки указывают проекции головы и тела нейронов хвоста. Экспрессия flp-34 в нейронах ASG (головная панель) была идентифицирована путем совместной локализации с маркерным трансгеном nlp-44p :: mCherry . Экспрессию flp-34 в PHA хвостового нейрона идентифицировали путем совместной локализации с окрашиванием DiI, тогда как ALN и PLN определяли по морфологии и положению (хвостовая панель).A, передний; P, задний; D, спинной; V, вентрально. Масштабные линейки 10 мкм. B , flp-34 действует в серотонинергических нейронах, регулируя обучение диацетилу. Вверху слева: экспрессия WT-копий flp-34 под контролем промотора tph-1 (NSM, HSN, ADF) в серотонинергических нейронах частично устраняет дефект обучения у мутантных животных flp-34 . Экспрессия flp-34 под контролем ops-1 (ASG) (вверху справа), gcy-27, (ASK, ASJ) (внизу слева) и gcy-17 (PHA) (внизу справа) промоторы не устраняют дефект обучения мутантов flp-34 .(NSM, HSN, ADF) Двусторонний дисперсионный анализ ANOVA выявил значительный эффект генотипов ( F _(2,63) = 5,333, p = 0,0072) поведенческих методов лечения ( F _{(1,63 )} = 267,4, p <0,0001) и взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(2,63) = 11,28, p <0,0001). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Сидака и Тьюки ( n ≥ 11). (ASG) Двусторонний дисперсионный анализ ANOVA выявил значительный эффект генотипов ( F _(2,40) = 9.418, p = 0,0004), поведенческих методов лечения ( F _(1,40) = 53,87, p <0,0001) и взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _{(2,40 )} = 6,521, р = 0,0035). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Сидака и Тьюки ( n = 8). (ASK, ASJ) Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительный эффект генотипов ( F _(2,66) = 16,66, p <0,0001) поведенческих методов лечения ( F _(1,66) = 194.3, p <0,0001), а также взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(2,66) = 15,59, p <0,0001). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Сидака и Тьюки ( n = 12). (PHA) Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительный эффект генотипов ( F _(2,66) = 16,77, p <0,0001) поведенческого лечения ( F _(1,66) = 161,6 , p <0,0001), а также взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(2,66) = 17.90, стр. <0,0001). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Сидака и Тьюки ( n = 12). Коробчатые диаграммы представляют 25-й (нижняя граница) и 75-й (верхняя граница) процентили. 50-й процентиль (линия) указывает медианное значение. Усы представляют собой минимальное и максимальное значения. Черные точки обозначают индивидуальные КЭ. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. нс, не имеет значения.

Учитывая корреляцию между передачей сигналов серотонина и состоянием питания в C.elegans (Srinivasan et al., 2008), мы предположили, что NPY / NPF-подобные нейропептиды передают сигналы от этих серотонинергических клеток, чтобы опосредовать обучение диацетилу. Мы клеточно-специфически восстановили экспрессию flp-34 в нейронах NSM, HSN и ADF с использованием промотора tph-1 (Sze et al., 2002), что позволило устранить дефект обучения диацетилу (рис. 7 B ). . Напротив, восстановление flp-34 в других нейронах, которые экспрессируют ген flp-34 , о чем свидетельствует экспрессия репортерного трансгена (рис.7 A ) или секвенирование одноклеточной РНК (Cao et al., 2017; Taylor et al., 2019) не спасло этот мутантный фенотип. Восстановление экспрессии flp-34 в нейронах ASK / ASJ, ASG или PHA не восстановило дефект обучения мутантов flp-34 (фиг. 7 B ). Это предполагает, что flp-34 специфически требуется в серотонинергических клетках для облегчения обучения диацетилу, а не то, что обучение опосредуется нерегулируемой секрецией нейропептидов. Вместе эти данные показывают, что нейропептиды, связанные с NPY / NPF, передают сигнал от серотонинергических нейронов и, возможно, других неидентифицированных клеток к NPR-11 в интернейронах AIA, регулирующих обучение диацетилу.

NPY / NPF-подобные нейропептиды FLP-34 и серотонин действуют одним и тем же путем, опосредуя обучение диацетилу

Требование flp-34 в серотонинергических нейронах для обучения диацетилу предполагает, что NPY / NPF-подобные нейропептиды и серотонин действуют вместе опосредовать аверсивное обучение. Чтобы исследовать это, мы протестировали обучение диацетилу для мутантов tph-1 , дефектных в биосинтезе серотонина. После кондиционирования у мутантов tph-1 обнаружен дефект обучения, который был более серьезным, чем у мутантов npr-11 (рис.8 А ). Это говорит о том, что серотонин, в дополнение к NPY / NPF-подобной передаче сигналов, опосредует обучение диацетилу. Затем мы создали двойной мутант tph-1; npr-11 , чтобы одновременно блокировать передачу сигналов серотонина и NPYR / NPFR, и сравнили обучение диацетилу одиночных и двойных мутантов. Дефект обучения, проявляемый мутантами tph-1; npr-11 , существенно не отличался от такового у мутантных животных tph-1 (фиг. 8, A ), что позволяет предположить, что серотонин и NPR-11 действуют одним и тем же путем. для регулирования обучения диацетилу (рис.8 В ).

Рисунок 8.

NPY / NPF-связанные нейропептиды FLP-34 и серотонин действуют одним и тем же генетическим путем, регулируя обучение диацетилу. A . Оба мутанта npr-11 и tph-1 обнаруживают дефекты обучения по сравнению с животными WT, причем дефект tph-1 является более серьезным. Двойной мутант npr-11; tph-1 не обнаруживает аддитивного дефекта обучения по сравнению с одиночными мутантами, что позволяет предположить, что npr-11 и передача сигналов серотонина действуют одним и тем же путем, опосредуя обучение диацетилу.Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительный эффект генотипов ( F _(3,47) = 5,888, p = 0,0017) поведенческого лечения ( F _(1,47) = 140,2, p <0,0001), а также взаимодействия между генотипами и поведенческими методами лечения ( F _(3,47) = 8,950, p <0,0001). Данные были проанализированы с помощью апостериорного теста Сидака и Тьюки ( n ≥ 5). Коробчатые диаграммы представляют 25-й (нижняя граница) и 75-й (верхняя граница) процентили.50-й процентиль (линия) указывает медианное значение. Усы представляют собой минимальное и максимальное значения. Черные точки обозначают индивидуальные КЭ. * p <0,5, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. нс, не имеет значения. B , Модель для NPR-11-опосредованного обучения диацетилу на основе данных из этой статьи (черный) и ранее опубликованных результатов (серый; см. Обсуждение). Диацетил воспринимается рецептором ODR-10 в сенсорных нейронах AWA (Sengupta et al., 1996). Активация AWA передается через электрические синапсы к интернейронам AIA, которые экспрессируют NPR-11 (Larsch et al., 2015). Отсутствие пищи приводит к состоянию голодания, которое воспринимается трехнейронной цепью, состоящей из дофаминергических (доп), RIC и SIA нейронов (Suo et al., 2009). Отсутствие пищи ведет к ингибированию передачи сигналов дофамина и, в свою очередь, к регулируемой CREB экспрессии генов в нейронах SIA (Suo et al., 2009). По неизвестным механизмам лишение пищи может вызвать высвобождение серотонина и нейропептидов FLP-34 из одного или нескольких серотонинергических нейронов.NPY / NPF-подобные нейропептиды FLP-34 передают сигнал AIA, активируя NPR-11 в этих нейронах, которые необходимы для обучения диацетилу. Серотонин (5HT) может активировать хлоридный канал, управляемый серотонином MOD-1 (Zhang et al., 2005). Красная заливка представляет собой часть цепи, активируемую восприятием диацетила. Синяя заливка представляет часть, активированную лишением пищи. Эти две цепи сходятся в AIA, где, вероятно, формируется память отвращения к диацетилу.

Обсуждение

Было показано, что несколько молекулярных механизмов обучения и памяти сохраняются во время эволюции (Glanzman, 2008; Ardiel and Rankin, 2010; Kandel, 2012).Растущее количество доказательств предполагает, что нейропептиды являются ключевыми модуляторами зависимого от опыта поведения (Bargmann, 2012). Здесь мы показываем, что NPY / NPF-родственные нейропептиды из серотонинергических нейронов передают сигнал через NPYR / NPFR ортолог NPR-11, чтобы опосредовать аверсивное обонятельное обучение у C. elegans .

Несколько биоинформатических исследований классифицировали C. elegans NPR как предполагаемые ортологи NPYR / NPFR (Keating et al., 2003). NPR-1 был впервые аннотирован как гомолог NPYR на основании сходства его последовательностей с человеческими NPYR (de Bono and Bargmann, 1998).Позже 11 дополнительных NPR C. elegans (NPR-2 до -8 и NPR-10 до -13) были предсказаны как гомологи NPYR / NPFR на основании филогенетического анализа C. elegans GPCR (Keating et al. , 2003). Тем не менее, филогенетический анализ нейропептидов GPCR в масштабах двух континентов показал, что большинство этих предполагаемых NPYR / NPFR в C. elegans тесно сгруппированы с короткими рецепторами NPF насекомых, что позволяет предположить, что это семейство в значительной степени расширилось у нематод (Jékely, 2013; Mirabeau and Жоли, 2013).Эти исследования также показали, что NPR-11 является подлинным ортологом C. elegans из семейства NPYR / NPFR, охватывающего все стороны билатерий (Jékely, 2013; Mirabeau and Joly, 2013). Недавнее исследование показало, что фармакологические концентрации человеческого NPY активируют C. elegans NPR-11 in vitro , тогда как такие же или более высокие концентрации человеческого NPY (10 мкм) вызывали слабые или нулевые ответы у других протестированных C. elegans НПР (Гершкович и др., 2019).

Здесь мы показываем, что NPY / NPF-подобные нейропептиды FLP-34 являются родственными лигандами NPR-11.Некоторые из наших результатов подтверждают ортологию этих нейропептидов с семейством билатерианских NPY / NPF: (1) предшественник нейропептида FLP-34 содержит два пептида, FLP-34-1 и FLP-34-2, которые демонстрируют структурные признаки билатерального NPY / НПФ нейропептиды. К ним относятся эволюционно консервативный C-концевой мотив RXRF / Yamide, который отличается от мотива M / T / L / FRFamide нейропептидов sNPF (Fadda et al., 2019). (2) Пептиды FLP-34-1 и FLP-34-2 дозозависимо активируют ортолог NPYR / NPFR NPR-11 in vitro со значениями EC ₅₀ в наномолярном диапазоне.(3) Ген flp-34 также обнаруживает консервативное соединение экзон-интрон, которое сохраняется в том же идентичном положении в большинстве проанализированных генов bilaterian npf / npy , включая насекомых ( A. aegypti , B . mori и D. pulex ), нематоды ( P. pacificus ), моллюски ( L. gigantea ), кольчатые червя ( C. capitata ) и позвоночные ( D. rerio, G. gallus , M. musculus и H. sapiens ) гомологами.Примечательно, что сохранение этой экзон-интронной структуры не сохраняется в Drosophila npf . Хотя предшественник FLP-34 содержит два зрелых NPY / NPF-подобных пептида, только С-концевая последовательность FLP-34-2 прерывается консервативным соединением экзон-интрон, что позволяет предположить, что FLP-34-1 может быть более поздним дупликация FLP-34-2 у нематод. Это подтверждается тем фактом, что предшественники NPY / NPF вне нематод продуцируют только один зрелый пептид, тогда как у нематод они содержат два NPF (McCoy et al., 2014).

Мы обнаружили, что FLP-34 экспрессируется в трех серотонинергических нейронах (NSM, HSN и ADF), в сенсорных нейронах ASG и в нейронах хвоста ALN, PLN и PHA, что согласуется с опубликованными одноклеточными RNA-seq. данные (Cao et al., 2017; Taylor et al., 2019). И данные RNA-seq, и наш профиль экспрессии свидетельствовали об экспрессии FLP-34 в дополнительных нейронах, хотя мы не смогли установить их идентичность в штамме репортерных фосмид. Мы показали, что нейропептиды FLP-34 передают сигнал от серотонинергических нейронов к NPR-11 в интернейронах AIA, чтобы опосредовать обучение диацетилу.Интернейроны AIA являются важными центрами сенсорной интеграции (Chalasani et al., 2010; Shinkai et al., 2011; Dobosiewicz et al., 2019), необходимыми для аверсивного, но не аппетитного обучения (Tomioka et al., 2006; Lin et al., 2010 ; Cho et al., 2016). В соответствии с этим мы показали, что npr-11 в AIA требуется для аверсивного обонятельного обучения. Аверсивное обучение — это эволюционно сохраняющаяся черта, которая позволяет животным избегать опасных ситуаций и выживать в конкурентной среде. У грызунов для обучения избеганию также требуется передача сигналов NPY (Morley et al., 1990; Gøtzsche and Woldbye, 2016). У взрослых Drosophila передача сигналов NPF опосредует аппетитное обучение в условиях голодания и, как полагают, имитирует отсутствие пищи (Krashes et al., 2009). Отсутствие пищи может также запускать высвобождение FLP-34 из серотонинергических нейронов C. elegans при обучении диацетилу. Это согласуется с нашими выводами о том, что недостаточная передача сигналов NPYR / NPFR в C. elegans не влияет на аппетитное обучение в парадигме положительной бутаноновой ассоциации, где черви подвергаются воздействию бутанона в присутствии пищи.

Как передача сигналов FLP-34 / NPR-11 модулирует аверсивное обонятельное обучение? Вместе с предыдущей работой наши результаты предлагают следующую модель обучения диацетилу (рис. 8 B ). Одновременная презентация диацетила с голоданием приводит к активации нейронов, чувствительных к запахам и состоянию питания. Диацетил воспринимается рецептором ODR-10 в нейронах AWA (Sengupta et al., 1996), которые, в свою очередь, деполяризуют интернейроны AIA через щелевые соединения (Larsch et al., 2015). С другой стороны, об отсутствии пищи сигнализирует цепь из трех нейронов, в которой октопамин запускает регулируемую CREB экспрессию гена в нейронах SIA, чтобы инициировать поведенческий ответ на голодание (Suo et al., 2009). Кроме того, серотонинергические нейроны хорошо известны своей ролью в передаче сигналов внутренних и внешних сигналов питания (Horvitz et al., 1982; Srinivasan et al., 2008). Мы показываем, что FLP-34 необходим серотонинергическим нейронам для обучения диацетилу, и лишение пищи, воспринимаемое этими нейронами, может запускать высвобождение FLP-34. Эта роль нейропептидов FLP-34 согласуется с эволюционно консервативной ролью NPY / NPF в передаче сигналов голода и питании (Sohn et al., 2013; Fadda et al., 2019).У млекопитающих модуляция пищевого поведения с помощью NPY в основном ограничивается ядрами гипоталамуса, где рецепторы Y1 и Y5 стимулируют орексигенную передачу сигналов в лишенных условиях (Kohno and Yada, 2012). У личинок Drosophila передача сигналов NPF увеличивает поведение поиска пищи и ингибирует локомоцию, чтобы способствовать питанию в условиях отсутствия пищи (Wu et al., 2005). В C. elegans NPR-11 в AIA, как было показано, модулирует поведение локального поиска при удалении червей из пищи (Chalasani et al., 2010), что напоминает NPF-регулируемое поведение поиска пищи у голодных Drosophila . Сигналы диацетила и пищевой депривации, таким образом, по-видимому, сходятся на интернейронах AIA, экспрессирующих NPYR / NPFR ортолог NPR-11.

В дополнение к FLP-34 наши результаты показывают, что серотонин модулирует обучение диацетилу, что согласуется с его ролью в качестве сигнала подкрепления в аверсивном ассоциативном обучении как у Drosophila , так и у C. elegans (Giurfa, 2006). На основании сообщений о роли серотонина в передаче сигналов о состоянии питания (Srinivasan et al., 2008; Донован и Текотт, 2013; Voigt and Fink, 2015) и его действие в качестве сигнала подкрепления в негативных ассоциациях (Giurfa, 2006; Sitaraman et al., 2017), передача сигналов серотонина также может усиливать сигнал о пищевой депривации в обучении диацетилу. Хотя его мишень в этом пути остается неизвестной, серотонин-управляемый хлоридный канал MOD-1 (Ranganathan et al., 2000), экспрессируемый в AIA, а также в большинстве интернейронов первого слоя C. elegans , может быть перспективный кандидат (рис.8 B ) (Harris et al., 2009). В другой парадигме аверсивного обучения, где патогенные бактерии служат аверсивным сигналом, активация MOD-1 при высвобождении серотонина приводит к ингибированию интернейронов первого слоя, включая AIA, и к изменению обонятельных предпочтений (Zhang et al., 2005). Похожий механизм может иметь место в обучении диацетилу. Все исследованные до настоящего времени нейропептиды билатерального NPY / NPF в основном обладают противовозбудительным действием на нейроны, экспрессирующие их рецепторы (Vollmer et al., 2016), что согласуется с сочетанием NPYR / NPFR с ингибирующей субъединицей G _{0 / i} α (Gershkovich et al., 2019). Это предполагает, что передача сигнала FLP-34 через NPR-11 может оказывать противовозбудительное действие на AIA, таким образом ингибируя AIA при высвобождении в среде, лишенной качественной пищи.

Передача сигналов NPR-11 при AIA также способствует локальному поиску и адаптации к изоамиловому спирту, поведению, опосредованному выделенными AWC нейропептидами NLP-1, которые действуют через NPR-11 при AIA (Chalasani et al., 2010). Наши результаты показывают, что NLP-1 не требуется для обучения диацетилу. Кроме того, наш анализ активации рецепторов показывает, что пептиды, полученные из flp-34 , но не nlp-1 , активируют NPR-11 in vitro . Это несоответствие в активации NPR-11 могло быть связано с различными системами клеточной экспрессии, используемыми в двух исследованиях: мы экспрессировали npr-11 в клетках CHO, тогда как Chalasani et al. (2010) использовали клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293. Предыдущие исследования показали, что на кальциевые ответы, вызванные активацией рецепторов в гетерологичных системах экспрессии, может влиять эндогенный клеточный контекст (Hermansson et al., 2007; Zhang et al., 2018). Таким образом, в зависимости от условий NPR-11 при AIA может быть активирован нейропептидами FLP-34, высвобождаемыми из серотонинергических нейронов, или нейропептидами NLP-1, высвобождаемыми из AWC. Эти данные свидетельствуют о том, что разные стимулы окружающей среды запускают высвобождение разных нейропептидов, которые, в свою очередь, активируют один и тот же рецептор в одном и том же нейроне, что приводит к изменению локомоторного движения, но в целом к ​​различному выходному поведению.

В заключение, мы идентифицируем сигнальную систему, связанную с NPY / NPF, и нейронный механизм для контроля аверсивного обонятельного обучения у C.elegans . Это открывает интересные перспективы для исследования скоординированного действия нейропептидов NPY / NPF и серотонина, опосредующего аверсивное подкрепление, в других парадигмах обучения, что может помочь в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе стрессовых расстройств, при которых чрезмерное избегание приводит к дезадаптивному поведению (Krypotos et al. , 2015).

Сноски

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

• Эта работа была поддержана грантом Европейского исследовательского совета 340318 и грантом Фонда исследований Фландрии G0C0618N.Генетический центр Caenorhabditis, финансируемый Управлением исследовательской инфраструктуры Национальных институтов здравоохранения P40 OD010440, за предоставление штаммов Caenorhabditis elegans , используемых в этом исследовании. Мы благодарим Кори Баргманн за предоставленный вектор pSM, штаммы CX8912 и CX7894 и советы по рукописи; и Gunther Hollopeter за предоставление вектора, экспрессирующего pGh596-Cas9.

• Переписку следует направлять Лилиан Шофс по адресу liliane.schoofs {at} kuleuven.be или Isabel Beets на isabel.beets {at} kuleuven.be

Процесс оценки препятствий FAA | Capitol Airspace Group

Застройщики, намеревающиеся построить сооружения на высоте более 200 футов над уровнем земли (AGL) или сверх установленных стандартов уведомления (ниже, ближе к аэропортам), должны подать уведомление в FAA не менее чем за 45 дней до начала строительства. .

До создания FAA системы автоматизации OE / AAA, уведомление было направлено FAA путем подачи формы FAA 7460-1, Уведомление о предполагаемом строительстве или изменении .Использование этой формы в значительной степени было заменено процессом подачи заявок через Интернет через веб-сайт FAA OE / AAA. FAA и отрасль продолжают называть эти документы «7460-1».

Для регистрации

7460-1 требуется очень базовая информация о проекте. В частности, Федеральное управление гражданской авиации требует, чтобы были предоставлены данные о местоположении конструкции, высоте над землей и высоте.

Поскольку FAA автоматически ставит под сомнение точность этой информации, Capitol Airspace часто рекомендует разработчикам пройти опрос FAA 1A до подачи этой заявки ( свяжитесь с нами, чтобы узнать больше об этом опросе ).Это обследование с печатью и подписью гарантирует, что FAA не применяет штрафы с погрешностью к окончательной утвержденной высоте конструкции.

В настоящее время необходимо подать 7460-1 документов по каждому пункту проекта (за некоторыми исключениями). Для проектов ветряных электростанций и линий электропередачи необходимо предоставить отдельные точки для каждой ветряной турбины, опоры MET и опоры линии электропередачи. Для строительных проектов обычно подшивается наружный след здания. После того, как FAA получило и проверило эти заявки, каждому поданному пункту присваивается номер авиационного исследования (ASN).Это начинает процесс авиационного обучения.

Capitol Airspace может подавать для вас файлы, отслеживать статус, работать с FAA и держать вас в курсе на протяжении всего проекта. Поскольку мы уже знакомы с проектами, которые подаем от имени клиента, мы готовы немедленно решить любые возникающие потенциальные проблемы.

Показать больше…

Шаг второй: начальная проверка

Знайте, чего ожидать.

Ваш проект будет передан специалисту в Группе оценки препятствий (OEG) FAA.Как правило, существует десять различных офисов внутри FAA и Министерства обороны (DoD), которые отвечают на OEG, в том числе: Управление аэропортов, группа столкновения с препятствиями, стандарты полетов, технические операции, управление частотами, ВВС, флот, армия, Информационный центр Министерства обороны (DoD), Департамент внутренней безопасности.

Технические специалисты в каждом из этих офисов будут проверять каждый пункт, чтобы убедиться, что предлагаемый проект не мешает их сферам ответственности.Если вы заказали Capitol Airspace провести аналитическое исследование воздушного пространства, вы будете знать, чего ожидать.

После того, как каждый из этих офисов оценил проект, они представляют ответ «возражения» или «нет возражений» через внутреннюю систему OE / AAA FAA. Во время этой части проверки FAA считает, что дело находится в «рабочем состоянии». Проверка всеми респондентами часто занимает от 45 до 90 дней.

После того, как все ответы были зарегистрированы в системе, дело переводится из «статуса незавершенной работы» в «статус оценки».На этом этапе специалист OEG оценит все ответы и определит, превышает ли конструкция стандарты препятствий, установленные в соответствии с 14 CFR Часть 77. Предлагаемые конструкции, которые превышают эти поверхности, считаются «препятствиями» и требуют дальнейшего изучения со стороны FAA, чтобы определить, являются ли они представляет опасность для аэронавигации.

Кроме того, сооружениям, которые считаются препятствием, обычно выдается Уведомление о предварительных результатах (NPF) (ранее называвшееся Уведомлением о предполагаемой опасности (NPH)).

Показать больше…

Шаг третий: предварительные результаты

Что такое Уведомление о предварительных результатах (NPF)?

Если ваш проект не получит положительного заключения «Не превышает», FAA, скорее всего, выпустит Уведомление о предварительных результатах (NPF) (ранее называвшееся Уведомлением о предполагаемой опасности (NPH)). Эти уведомления гарантируются для всех конструкций, высота которых превышает 499 футов над уровнем земли (AGL).

Письмо о NPF предназначено для того, чтобы FAA могло уведомить разработчика о том, что оно выявило проблему, которая потребует дальнейшего изучения, чтобы определить, будет ли данная конструкция представлять опасность для аэронавигации.Это письмо предназначено для начала переговоров между разработчиком и FAA.

На этом этапе разработчик может либо уменьшить высоту предлагаемой конструкции, либо удалить предложение, либо потребовать от FAA проведения дополнительных авиационных исследований на первоначально заявленной высоте.

Шаг четвертый: ответ на уведомление о предварительных результатах (NPF)

У вас есть варианты.

Несмотря на то, что существует множество методов разрешения возражений, полученных по проекту, почти все случаи НРП должны быть переданы общественности для комментариев.В течение этого 37-дневного периода общественного обсуждения FAA может собрать информацию о фактическом воздействии на местное летное сообщество.

Если вы работаете с Capitol Airspace, мы можем предложить варианты смягчения последствий, которые позволят найти баланс между экономической потребностью вашего проекта и необходимостью FAA сохранить Национальную систему воздушного пространства (NAS).

Варианты

могут включать в себя предлагаемые изменения схем захода на посадку по приборам, оценку ретроспективных данных радиолокационного слежения для определения уровня значимости или встречу с аэропортом для понимания и решения проблем.На этом этапе разработчики в значительной степени полагаются на Capitol Airspace при разработке и реализации стратегий смягчения последствий.

Шаг пятый: окончательные решения

Мы почти закончили, но еще не совсем.

Положительные заключения об отсутствии опасности действительны в течение 18 месяцев. Можно запросить единовременное продление. Этот запрос будет дополнительно рассмотрен FAA OEG и может привести к дополнительным 18 месяцам.

Ваши благоприятные заключения могут включать требования по маркировке и освещению в соответствии с действующим Консультативным циркуляром FAA 70 / 7460-1, уведомляя определенные авиационные объекты о начале вашего строительства или уведомляя FAA после завершения строительства.

Кроме того, вам также необходимо будет зарегистрировать временное строительное оборудование, если оно будет выше, чем постоянное строение.

Шаг шестой: После завершения строительства

Может потребоваться дополнительное уведомление.

В зависимости от требований в вашем решении дополнительное уведомление может потребовать от вас уведомить FAA до или вскоре после строительства.

Это позволяет FAA нанести на карту ваш проект, чтобы пилоты знали о новой структуре.

Топ

НАША КУЛЬТУРА

Мы гордимся своей способностью помогать аэропортам и разработчикам найти баланс между необходимостью экономического развития и сохранением национальной системы воздушного пространства. Наши специалисты выявляют, изучают и решают проблемы, связанные с воздушным пространством и вторжением в аэропорт.

Подробнее о нас
Карьера в Capitol Airspace

Авторские права © 2017 Capitol Airspace Group, LLC. Все права защищены.

НПФ основные моменты | EAFO

Скачать полную документацию НПФ:

Английский перевод: france npf.en.pdf

Оригинальный язык: france npf.pdf

Основные характеристики НПФ и отчет о реализации НПФ за 2019 год

На этой странице мы предоставляем соответствующую информацию по теме транспортных средств, использующих альтернативные виды топлива, инфраструктуры или мер поддержки, как это предусмотрено в Основах национальной политики (НПФ) , а также Отчетность государств-членов за 2019 год о реализации НПФ .

Согласно ст.10 (1) Директивы об инфраструктуре альтернативных видов топлива, каждое государство-член должно представлять Европейской комиссии отчет о реализации своей национальной политики каждые три года и впервые не позднее 18 ноября 2019 г. Отчеты должны содержать описание мер, принятых в представляющем отчет государстве-члене в поддержку создания инфраструктуры альтернативных видов топлива. Обзор отчетов, уведомленных [государством-членом] и полученных Комиссией к настоящему времени, представлен ниже (раздел загрузки), включая перевод на английский язык, где это применимо.

Основные моменты для всех Основ национальной политики имеют более или менее одинаковую структуру: сначала мы объясняем подход к моделированию там, где он был предоставлен, затем мы объясняем цели или ключевые направления деятельности НРП, а затем даем обзор ключевых сообщений для тех альтернативных видов топлива с четкими требованиями к инфраструктуре, для которых государства-члены должны были разработать национальные цели в соответствии с Директивой об инфраструктуре альтернативных видов топлива (электричество, водород, сжиженный нефтяной газ, КПГ и СПГ — поэтому не охватываются, например, биотопливо или синтетическое топливо. Основные моменты: выдержка s из документов НПФ . Эти основные моменты не следует рассматривать как краткое изложение НРП. Для полного и полного обзора советуем прочитать документ НПФ s .

Основные моменты 2019 Отчет о реализации НПФ

Публикация основ национальной политики в 2017 году стала частью общей стратегии энергетического перехода на транспорте, как это предусмотрено в Законе о энергетическом переходе для зеленого роста (loi relative à la transition énergétique pour la croissance verte — LTECV) от августа 2015 года и включен в предложение по интегрированному национальному плану в области энергетики и климата (plan national intégré énergie-climat).Несколько документов поддерживают разработку альтернативных видов топлива:

1 Национальная низкоуглеродная стратегия (Stratégie Nationale Bas-Carbone — SNBC) устанавливает стратегические ориентиры для реализации перехода к низкоуглеродной и устойчивой экономике во всех бизнес-сегментах. Он устанавливает целевые показатели сокращения выбросов парниковых газов для каждого сектора экономики посредством «углеродных бюджетов», которые устанавливают потолочные значения выбросов парниковых газов на последовательные периоды от 4 до 5 лет.

2 Многолетний энергетический план (Programmation pluriannuelle de l’énergie — PPE), стратегический документ французской энергетической политики, устанавливает два основных приоритета: сокращение потребления энергии, особенно ископаемого топлива; и развитие возобновляемых источников энергии.В транспортном секторе в проекте пересмотра СИЗ (PPE2) будут установлены цели по снижению энергопотребления и разработке электрических или гибридных электромобилей, а также по развитию био-газомоторного топлива и водорода.

3 Стратегия развития чистой мобильности (Stratégie de développement de la mobilité propre — SDMP), прилагаемая к Многолетней энергетической программе, устанавливает руководящие принципы декарбонизации транспорта. В предложении SDMP2, приложенном к пересмотренному проекту PPE (PPE2), будут установлены новые цели на 2023 и 2028 годы (первые задачи SDMP на 2016-2018 годы).Эта стратегия ориентирована, в частности, на более широкие цели национальной стратегии по снижению выбросов углерода. SDMP в основном разъясняет сценарии тенденций, касающихся автопарков, перспективы увеличения количества точек подзарядки для увеличения альтернативных видов топлива, изменения с точки зрения потребления транспортных средств различных источников энергии и предлагаемые руководящие принципы для каждого из рычагов (декарбонизация топлива, потребляемого транспортными средствами, энергоэффективность транспортных средств, контроль спроса на транспорт, смены вида транспорта, оптимизация использования транспортных средств).Представленные в отчетной таблице оценки парка транспортных средств, использующих альтернативные виды топлива, а также оценки, относящиеся к количеству точек заправки и заправки, поэтому основаны на целях предложения SDMP2, которое все еще ожидает принятия; поэтому пока эти оценки развертывания флота не являются обязательствами Франции. SDMP был составлен со ссылкой на сценарий, также используемый SNBC и PPE.

Электроэнергия : В настоящее время порт Марселя имеет 3 точки снабжения для 5 паромов La Méridionale и Corsica Linea, курсирующих между Корсикой и материковой частью Франции.Южный (Южный) регион недавно объявил о своей новой схеме электрификации «нулевых остановок в пути» (Escales zéro fumées), в результате которой к 2023 году должны быть подключены все паромные причалы. Схема также должна позволять установку питания для круизных судов в Марсель к 2025 году. Правительство Франции объявило о своем намерении поддержать схему региона (см. 3. Отчет о развертывании и производстве в таблице отчетности). Grand Port Maritime в Дюнкерке также планирует до конца года оснастить свой контейнерный терминал точкой снабжения мощностью 8 МВт; Первоначально он должен обслуживать 7 судов.Также есть планы установить 2 дополнительных точки снабжения в зависимости от того, как меняются потребности. В секторе внутренних водных путей электрификация набережных набирает обороты, поскольку некоторые водные пути, не включенные в цели CANCA, также предлагают ее или в настоящее время устанавливают. Одним из таких случаев является Рона, на которой объекты в Вьенне и Арле теперь имеют 2 точки электроснабжения высокой мощности, с 7 точками электроснабжения средней мощности в сетях Compagnie Nationale du Rhône и государственных водных путях Франции (VNF). ).Бассейн Сены также является получателем инвестиций VNF в партнерстве с HAROPA (союз портов Гавра, Руана и Парижа) и при поддержке французского правительства, ADEME и CEF-T, что позволило установить 9 точки водоснабжения и электроснабжения, каждая из которых рассчитана на 2 судна. Всего во французской сети внутренних водных путей в 2019 году было не менее 110 точек электроснабжения для судов внутреннего плавания (в том числе 17 в районе бассейна Сены и 91 в районе Нор-Па-де-Кале).

Водород : Сегодня во Франции 29 водородных станций, развертывание которых поддерживается в основном схемой маркировки «Territories hydrogène». В 2018 году правительство приняло План развертывания водородной энергетики в переходный период (Plan de déploiement de l’hydrogène pour la transition énergétique), установив целевые показатели по развертыванию транспортных средств и станций, которые будут добавлены к SDMP, когда он будет принят. План не определяет дифференцированных целей между станциями, открытыми для публики, и станциями для пленного флота.К 2023 году необходимо будет развернуть 100 станций, что является значительным увеличением по сравнению с целевым показателем CANCA на 2025 год от 30 до 50 станций.

Природный газ : На момент уведомления о Основах национальной политики Франция установила национальный целевой показатель в 80 точек заправки КПГ, чтобы к концу 2020 года обеспечить движение транспортных средств, работающих на КПГ. К концу 2019 года эта цель была достигнута. достигнуты 110 АГНКС и 34 СПГ станции. На 2023 и 2028 годы в предложении SDMP указано количество станций, необходимых для доставки прогнозируемого количества транспортных средств.Таким образом, к 2023 году Франции потребуется не менее 121 АГНКС и 17 АГНКС; К 2028 году необходимо будет установить 285 станций КПГ и 41 станцию ​​СПГ. Анализ показывает, что Франция должна превзойти эти цели.

Заправка СПГ в портах: Все порты с причалами для перевозки СПГ (Марсель-Фос, Дюнкерк, Нант-Сен-Назер) в настоящее время предлагают услуги по бункеровке СПГ грузовиками. Несмотря на отсутствие терминала, порт Гавра использует грузовики для заправки СПГ.

Основные моменты НПФ (дата принятия: 2018 г.)

Франция ставит перед собой цель диверсифицировать структуру энергопотребления в транспортном секторе, независимо от вида транспорта, в частности, за счет продвижения электромобильности, транспортных средств, работающих на природном газе (КПГ / СПГ) и био-КПГ / СПГ, биотоплива, СНГ и биотоплива.Выявлено несколько неопределенностей, связанных с перспективами развития альтернативных видов топлива. Неопределенности, связанные с изменением цен на энергоносители, напрямую влияющие на привлекательность некоторых АФ. Неопределенности, связанные с изменением автопарка и конкуренцией между видами топлива для транспортных средств. Различные альтернативные виды топлива могут удовлетворить потребности одного и того же сегмента транспортных средств. Помимо сопоставления различных сегментов транспортных средств и видов топлива, необходимо учитывать неопределенность в этих различных сегментах, поскольку цель состоит в том, чтобы избежать развития инфраструктуры, не имеющей экономической ценности.Так обстоит дело с автобусами, которые могут работать на КПГ, СПГ, водороде или электричестве. Аналогичным образом, что касается водорода, расширение ассортимента аккумуляторных батарей для электромобилей может в конечном итоге оказать давление на рыночные сегменты определенных транспортных средств. Неопределенности, связанные с поведением, особенно в отношении электричества, которое характеризуется моделью заправки, сильно отличающейся от традиционной модели.

Электроэнергия : В рамках стратегии развития чистой мобильности Франция поставила перед собой цель выпустить в 2023 году 2 400 000 электромобилей и гибридных электромобилей (легковые автомобили и малотоннажные коммерческие автомобили).Ожидается, что снижение стоимости аккумуляторов и увеличение дальности действия помогут электромобильности получить более широкое распространение.

Электричество — береговое электричество (SSE или OPS): в настоящее время только один морской порт Франции (Марсель-Фос) предлагает подключение к электросети большой мощности (более 1 МВА), предназначенное для торговых судов, находящихся в порту. Социально-экономическая оценка определила минимальные условия (заполняемость причала, плотность окружающей городской среды и т. Д.), Необходимые для того, чтобы услуги по подаче электроэнергии на берегу были экономически эффективными с социально-экономической точки зрения, и оценили причалы, которые будут наиболее целесообразно оборудовать и подключить к электросети к 2025 году.Развитие услуг по электроснабжению на берегу должно быть сосредоточено на терминалах ро-ро, которые принимают суда RoPax (автомобили и пассажиров), и на терминалах круизных судов, расположенных близко к густонаселенной городской зоне. Порты Парижа, Страсбурга, Гавра, Руана, Лилля и Лиона для внутреннего водного транспорта, вероятно, будут предлагать береговое электроснабжение к 2025 году. Следует отметить, что предложение берегового электроснабжения зависит от типа судна и причала.

Электричество — самолеты на терминалах: подавляющее большинство аэропортов имеют 400-герцовые связи для тех стоянок, которые являются частью терминалов, для семи основных аэропортов оборудованы 504 из 625 стоянок на терминалах.

Hydrogen : Франция отдает предпочтение «кластерному» подходу или «внутреннему флоту» для разработки водорода на национальной территории. Эта стратегия запуска сразу удовлетворяет потребности с точки зрения запаса хода и скорости дозаправки, которые в настоящее время не удовлетворяют электромобили, одновременно снижая риски, связанные с развитием новой инфраструктуры: развертывание транспортных средств и станций там, где есть спрос, чтобы гарантировать, что станция достаточно используется с момента открытия.

CNG : Разработка природного газа для транспорта во Франции первоначально была сосредоточена на рынке общественного транспорта, и в настоящее время у многих местных властей есть автобусный парк, работающий на КПГ.С тех пор он был распространен на автомобили для уборки улиц и малотоннажный транспорт. В 2005 году КПГ был предметом соглашения между государственными органами и несколькими операторами этого сектора с целью обеспечить его более широкое использование в сегменте легких транспортных средств и среди частных лиц. Однако его использование в легковых автомобилях по-прежнему значительно ниже целевых показателей, установленных соглашением. По состоянию на конец 2015 года во Франции насчитывалось немногим более 12 000 автомобилей, работающих на КПГ, в основном это автомобили, находящиеся в нерабочем парке и имеющие доступ к специальным заправочным станциям.

СПГ : Использование СПГ в грузовиках большой грузоподъемности быстро растет. Во Франции реализуются или были объявлены несколько проектов с участием станций, доступных для большегрузных автомобилей, инициированных местными государственными заинтересованными сторонами и / или частными операторами. Во Франции годовой спрос на морской СПГ к 2025 году может составить от 150 до 500 тыс. Тонн. Ожидается, что первоначальными основными потребителями морского СПГ будут круизные суда. Если будет реализован оптимистичный сценарий спроса, предложение по заправке СПГ на судах может быть расширено на другие порты в базовой сети TEN-T и даже на определенные порты в комплексной сети TEN-T.Что касается внутренних портов, то неопределенность относительно будущего спроса все еще слишком велика, чтобы определить цель в рамках временных рамок Директивы.

НПФ «Будущее», НПФ «Сафмар» перед спасением продали акции Промсвязьбанка

15 декабря 2017 18:20

НПФ «Будущее» и НПФ «Сафмар» перед спасением продали акции Промсвязьбанка — источники

МОСКВА. 15 дек. (Интерфакс) — НПФ «Будущее» и НПФ «Сафмар» продали свои 10% -ные доли в Промсвязьбанке на Московской бирже, сообщили «Интерфаксу» два источника на финансовом рынке.

В пятницу, 15 декабря, Центральный банк объявил, что предпринимает меры по предотвращению банкротства Промсвязьбанка, «направленные на повышение финансовой устойчивости банка». Накануне объем торгов акциями Промсвязьбанка на Московской бирже достиг невиданного ранее уровня в 16,5 млрд руб.

Источники не назвали покупателей акций.

Интерфаксу не удалось получить комментарий НПФ «Будущее», хотя источник, близкий к фонду, подтвердил, что в его портфеле не осталось акций Промсвязьбанка.

НПФ «Сафмар» не комментирует размещение акций Промсвязьбанка. Источник, близкий к фонду, сказал, что не видит рисков отрицательной переоценки этих акций.

Два пенсионных фонда приобрели доли в банке в ходе SPO в 2015 году.

акций Промсвязьбанка в четверг стоили в среднем 0,0741 рубля каждая, то есть 10% акций банка стоили бы 8,2 млрд рублей.

Пенсионные фонды, принадлежащие B & N Group (ныне Safmar), выкупили около 10% акций Промсвязьбанка у Промсвязь Капитал Б.V., принадлежащая братьям Алексею и Дмитрию Ананьевым, за 6,9 млрд рублей в ходе SPO в мае 2015 года. Пенсионный фонд «Благосостояние НПС», ныне «Будущее», принадлежащий Борису Минцу, также купил 10% за 6,9 млрд рублей. Сделки проводились на Московской бирже, и Промсвязь Капитал позже внес выручку от продаж в капитал банка.

В настоящее время в «Будущем» накоплено 291,7 млрд рублей пенсионных накоплений, в пенсионном фонде «Сафмар» — 190,4 млрд рублей.

Начало новой эры пенсионной системы России

Раздел MT Conferences не касался репортажей или редакции The Moscow Times.

Даниил Хавронюк

Начальник отдела коммуникаций и PR

Пенсионный фонд Райффайзен

Трудно сейчас писать о пенсиях, поскольку текущая политическая повестка дня затмевает и затмевает — или, лучше сказать, затмевает? — любые долгосрочные концепции. В то же время естественный образ жизни еще никто не изменил, и люди с каждым днем ​​стареют, уходят с карьеры и в старости нуждаются в пропитании.Вопрос о пенсиях как никогда актуален.

После дождя

Пыль улеглась после того, как быстрый и яростный раунд пенсионной реформы в конце 2013 года прошел через необходимые законодательные процедуры и стал новой реальностью. Появились первые ощутимые последствия.

На прошлой неделе появилась первая партия статистических данных за 2013 финансовый год. По словам представителей правительства, в 2013 году рекордные 15,9 миллиона человек подали заявки на перевод своего счета ОПС (накопительный компонент российской пенсионной системы для лиц 1967 года рождения и младше) в НПФ (негосударственные пенсионные фонды).Эти заявки еще предстоит подтвердить, но даже по самым скромным подсчетам, у НПФ появляется 13 миллионов новых счетов, а их общая клиентская база составляет более 33 миллионов человек — из 77 миллионов, имеющих право на этот пенсионный компонент.

В 2014 году, однако, энтузиазм, вызвавший такой всплеск переводов со счетов, будет подавлен: PFR (государственный пенсионный фонд) покончил с системой агентов по переводу, которые позволяли НПФ проверять личность и подпись клиента, тем самым принимая заявки на перевод счета на имени ПФР.В этом году любой желающий вывести свой счет из ПФР должен будет обратиться в ПФР напрямую (лично или по почте нотариально заверенным заявлением) и подписать договор с НПФ. Российская ДНК предлагает обойти все официальные органы и / или связанные с ними документы, обещая множество трудоемких и болезненных повторений. Хотя отделения ПФР и специализированные многофункциональные центры государственных услуг в последнее время проделали огромную работу по сокращению хлопот, недоверие и настороженное отношение все еще остаются довольно сильными.

Что может подстегнуть отстающих, так это то, что окно возможностей закроется через два года: после 31 декабря 2015 года не будет финансируемых OPS, кроме как во вселенной NPF. Для тех, чьи счета OPS находятся в НПФ (или в уполномоченной компании по управлению активами, или в выделенном портфеле в ВЭБе, если быть точным), 6-процентный тариф будет сохранен, в то время как для других их банки OPS будут, скорее всего, заморожены до пенсионного возраста.

Выживание сильнейшего

Для пенсионной индустрии это означает, что клиентская база OPS будет сформирована к концу 2015 года, и после этого будет добавляться лишь небольшая струйка новых участников.Сегодня конкуренция между НПФ довольно низкая, так как все участники рынка кусают «молчунов», счета которых до сих пор находятся в ПФР. Однако, начиная с 2016 года, ситуация будет усложняться, и средства должны будут начать собирать информацию среди клиентов друг друга. Ситуация усугубится из-за нового правила смены поставщика OPS раз в пять лет; В довершение ко всему, страховые компании давно присматриваются к деньгам OPS, есть вероятность, что им скоро разрешат выйти на рынок.

Однако есть балансирующий фактор, который отбраковывает стаю НПФ до того, как они схлестнутся друг с другом в борьбе за клиентов: двойное мелкое сито, которое в настоящее время работает, присоединяется к системе пенсионных накоплений и становится акционерным.

Краткое напоминание: НПФ, желающие продолжить работу с OPS, должны будут перейти на акционерный формат. Как надеются правительство и регулирующие органы, это повысит прозрачность сектора. Однако не все фонды выстраиваются в очередь за новым статусом — некоторые кэптивные фонды, управляющие корпоративными пенсиями крупных монополий, предпочли бы свернуть свои операции OPS, чем потерять свой некоммерческий характер. Создание акционерного капитала будет означать раскрытие информации о бенефициарах и ужесточение правил, в том числе в отношении операций со связанными сторонами, а также консолидацию в балансе и бухгалтерской отчетности учредителя, чего материнские структуры очень хотят избежать.Кроме того, чтобы иметь право управлять счетами OPS, каждый НПФ должен будет присоединиться к национальной системе пенсионной защиты, предварительно получив разрешение от ЦБ РФ.

В чем дело?

Существуют два важных события, которые будут способствовать дальнейшим спекуляциям и прогнозам: публикация ЦБ РФ статистики пенсионного сектора за 2013 г. (ожидается в апреле) и первые одобрения ЦБ РФ присоединения НПФ к системе пенсионных гарантий и завершения их складирования (ожидается в осень 2014 г. не ранее).В то время как первый предоставит снимок сектора «как есть», второй даст возможность «быть». Следите за нами в The Moscow Times, и мы будем держать вас в курсе!

Раздел MT Conferences не касался репортажей или редакции The Moscow Times.

.